بخشی از مقاله
چکیده
در این پژوهش، پروتئین کلاژن از مدوز عروس دریایی Catostylus tagi جداسازی و خالصسازی شد . جهت بررسی محتوای پروتئین کلاژن در این گونه و استحصال ترکیبات کلاژنی، از روش استخراج کلاژن محلول در پپسین 10 درصد استفاده شد. کلاژن استخراج شده توسط الکتروفورز ژل پلی آکریل آمید در حضور سدیم دو دسیل سولفات - SDS-PAGE - مورد ارزیابی قرار گرفت. نتایج بیانگر آن بود که این ترکیبات دارای دو زنجیرهی متفاوت از نوع α1 - α و - α2 بوده و مشابه پروتئین کلاژن نوع I در پستانداران هستند. وزن مولکولی زنجیرههای α کلاژن بین 60-70 کیلودالتون مشاهده شد. بنابراین، با توجه به شباهت ساختاری پروتئین کلاژن عروسدریایی در این تحقیق با کلاژن نوع I پستانداران، میتوان ترکیبات کلاژنی عروس-دریایی گونهی Catostylos tagi را به عنوان جایگزین مناسب و یک بیوپلیمر ارزشمند در طراحی و ساخت محصولات دارویی، آرایشی بهداشتی و مکمل های غذایی معرفی نمود. روش استخراج کلاژن از عروسدریایی با استفاده از پپسین 10 درصد نیز به عنوان روشی ساده و مقرون به صرفه پیشنهاد گردید. بنابراین با توجه به فراوانی بالای گونهی عروسدریایی Catostylos tagi در سواحل خوزستان، استحصال و بهرهبرداری پایدار از این موجودات با ارزش دریایی دارای ارزش اقتصادی بالا در حوزه زیست فناوری دریا میباشد.
کلمات کلیدی: Catostylus tagi، کلاژن دریایی، SDS-PAGE، بحرکان، خلیج فارس
مقدمه
کلاژن یک پروتئین فیبریلار است که تشکیل دهنده بافتهای همبند بسیاری از بخشهای بدن از جمله استخوان، غضروف، تاندون و پوست میباشد. امروزه تحقیقات متعدد بیانگر این است که پروتئین کلاژن علاوه بر ویژگیهای ساختاری و عملکردی، از عوامل اصلی القا کننده و تنظیم کننده بسیاری از فرایندهای سلولی همچون تمایز سلولی، حرکت، ارتباطات و القاء آپوپتوز محسوب میشود . - Brodsky, 1982; Xiong, 2008 - هر چند اصلیترین عملکرد این پلیمر طبیعی، تشکیل فیبریلهای غیر قابل حل با حداکثر مقاومت میباشد. کلاژن ترکیب اصلی ماتریکس خارج سلولی بوده و تاکنون بیش از 27 ایزوفرم ژنتیکی از آن شناسایی شده است.
کلاژنهای نوع I و II و III، فراوانترین و معروفترین کلاژنهای کاربردی در زیست پزشکی میباشند. این مشتقات بهعنوان بیوپلیمر نقش مهمی را در پزشکی، داروسازی، صنایع آرایشی بهداشتی و صنایع غذایی ایفا میکنند - . - Xiong, 2008 از این بین، کلاژن نوع I، بهعنوان Natural scaffold و کاندید مهمی در مهندسی بافت، جهت بازسازی و بهبودی زخمها و Reconstructive medicine شناخته شده است . - Calejo et al ., 2012 - این ویژگیهای ارزشمند، عمدتابدلیل دارا بودن خصوصیات منحصر بفرد فیزیکی و شیمیایی مشتقات کلاژنی است. کلاژن نوع اول اغلب شامل فیبریلهای با طول 300 نانومتر و ابعاد تا 1000 نانومتر است. این نوع کلاژن Trimeric بوده و بصورت مارپیچ سهتایی - Triple Helix - می-باشد.
مارپیچها دارای تکرارهای مشخص Gly-X-Y هستند که در آنها اغلب X و Y به ترتیب پرولین و هیروکسی پرولین می-باشند. بنابراین پرولین و هیدروکسی پرولین، تقریبا %23 از توالی پروتئینی را تشکیل میدهد و ساختار Gly-Pro-Hyp معمولترین فرم موجود میباشد. محتوای هیدروکسی پرولین کلاژن از پستانداران مختلف تاکنون استخراج شده است که مقدار آن تقریبا %14 گزارش شده است . - Glowacki, 2008 - بدلیل تنوع فوقالعاده در بافتهای موجودات زنده و انواع پروتئینهای کلاژنی، توسعه یک روش استاندارد استخراجی برای تمام انواع بافتهای موجودات کاری بسیار دشوار میباشد. پیوندهای کوالان بین مولکولی در ساختار کلاژن وجود دارند که در اکثر موارد در محلولهایی که جهت حلالیت پروتئینها استفاده میشوند بصورت غیر قابل حل میباشند . - Brodsky, 1982; Xiong, 2008 -
امروزه بدلیل کاربرد گسترده کلاژن در صنایع مختلف، نیاز به دسترسی به منابع جدید کلاژنی بیش از پیش احساس میشود. همچنین بدلیل بروز برخی از بیماریها مانند جنون گاوی و احتمال انتقال بیماری به انسان و افزایش ریسک استفاده از ترکیبات کلاژنی موجود و همچنین عدم استفاده از کلاژن خوک در کشورهای اسلامی بدلیل محدودیتهای شرعی، استحصال ترکیبات کلاژنی از منابع عظیم و در دسترس دریایی بسیار حائز اهمیت است.هدف در این پژوهش، استخراج و خالصسازی کلاژن از بافتهای عروس دریایی گونه Catostylus tagi و ارزیابی محتوای کلاژنی بدست آمده با استفاده از روش استخراج هضم آنزیمی پپسین و معرفی این ترکیب استحصالی بهعنوان کاندید مناسب جهت بهرهبرداری بهینه و پایدار بوده است.
مواد و روشها
نمونهبرداری در زمان فراوانی گونه در اسفند ماه از عمق 10 متری آبهای ساحلی بحرکان در استان خوزستان با استفاده از تور ماهیگیری انجام شد. نمونههایی که دارای اندازه چتر تقریبا 25 سانتیمتر بودند با فرض داشتن بهترین کیفیت محتوای کلاژنی، انتخاب شدند. در زمان نمونه برداری دقت شد نمونهها از ناحیه چتر، آسیب نبینند. نمونههای عروس دریایی بههمراه آب دریا و بلافاصله پس از صید، به آزمایشگاه منتقل شدند. پس از شستشوی نمونهها با آب دریا و سپس با آب مقطر دو بار تقطیر، بازوهای دهانی جدا شده و جهت انجام ادامه کار، چترها جداسازی شدند. پس از برداشتن پوست داخلی و خارجی چتر، باقیمانده بافت، ابتدا فریز درای شده و سپس در دمای -80 درجه سانتیگراد نگهداری شد.
جداسازی و خالصسازی کلاژن عروس دریایی گونه Catostylus tagi طبق روش Nagai و همکاران 1999 و با اعمال اندکی تغییرات در این تحقیق، انجام شد. تمامی مراحل در دمای 4 درجه سانتیگراد صورت گرفت. بدین ترتیب که بهمنظور جداسازی پروتئینهای غیر کلاژنی، بخشهای آمادهسازی شده نمونههای لیوفیلیزه ابتدا با محلول 0/1 NaOH مولار تیمار شدند. محلول بهصورت روزانه تعویض شده و پس از 72 ساعت مجددا بافت مورد نظر فریز درای و در -80 درجه سانتیگراد نگهداری شد. سپس برای مدت 72 ساعت دیگر، تحت تاثیر اسید استیک 0/5 مولار قرار گرفتند. ماده نامحلول بدست آمده با دور 12 هزار به مدت 1 ساعت سانتریفیوژ شده و پس از افزودن محلول اسید استیک در دمای -20 درجه سانتیگراد نگهداری شد. رسوب ایجاد شده سپس
نتایج
تحت تاثیر آنزیم پپسین 10 درصد - وزنی/حجمی - در محلول اسید استیک 0/5 مولار و برای مدت 48 ساعت قرار گرفت. محلول هضم شده سانتریفیوژ شده و سپس مواد غیر محلول جدا شدند. در این مرحله، دیالیز در حضور 0/02 Na2HPO4 مولار در pH=7/2 و آب به مدت 72 ساعت انجام شد. سپس رسوب بهدست آمده با دور 12 هزار و بهمدت 1 ساعت سانتریفیوژ شده و مجددا تحت تاثیر اسید استیک 0/5 مولار قرار گرفت. در این مرحله، نمک زدایی با افزودن NaCl به غلظت نهایی 1 مولار انجام شد. پس از سانتریفیوژ، رسوب حاصل، در اسید استیک 0/5 مولار حل شده، دیالیز شده و مجددا سانتریفیوژ انجام شد. محصول نهایی بدست آمده مجددا لیوفیلیزه گردید.
به منظور حصول اطمینان از جداسازی و حضور ترکیبات کلاژنی استخراجی از گونه Catostylus tagi، الکتروفورز ژل سدیم دودسیل سولفات پلی اکریلامید SDS-PAGE با اعمال اندکی تغییرات انجام شد. بدین ترتیب که نمونههای لیوفیلیزه ابتدا در بافر فسفات 0/02مولار حاوی - %1 SDS وزنی/حجمی - و اوره 3/5 مولار قرار گرفتند. سپس در مقادیر 5، 7/5 و 10 درصد پلی اکریلامید، الکتروفورز انجام شد. جهت رنگآمیزی قطعات پروتئینی از رنگ کوماسیبلو - Fluka Chemie, Switzerland - R-250 استفاده شد. نشانگر پروتئینی - 6.5-116 kDa - در این تحقیق به عنوان مارکر استاندارد مورد استفاده قرار گرفت.
طبق نتایج بدست آمده در این پژوهش، استخراج کلاژن با استفاده از پپسین ده درصد با موفقیت همراه بود و در نهایت کلاژن محلول در پپسین با اضافه کردن NaCl رسوب نمود. نتایج مشاهده شده بر روی ژل الکتروفورز و مقایسه با مارکر استاندارد، حضور سه ناحیه شامل سه زنجیره آلفا، بتا و گاما را نشان داد - زنجیره با وزن مولکولی 60-70 کیلودالتون، زنجیره با وزن مولکولی 90-116 کیلودالتون و زنجیره با وزن مولکولی بین 116 تا 250 کیلودالتون - . براساس نتایج بدست آمده کلاژن استخراج شده از دو نوع زنجیره 1 و زنجیره 2 که دارای وزن مولکولی متفاوت هستند؛ تشکیل شده است. این نتیجه نشان میدهد که کلاژن استخراج شده، مشابه با کلاژن I پستانداران است. همچنین واحدهای زیر ساختاری و - اجزای غیر غالب - قابل مشاهده هستند - شکل . - 1
بحث و نتیجه گیری
در جمعآوری عروسهای دریایی، نمونههایی انتخاب شدند که اندازه چتر حدودا 25 سانتیمتری داشته باشند به دلیل اینکه طبق تحقیقات انجام شده، در مدوزهای بالغ با اندازه چتر بزرگتر، احتمالا ایجاد حالت اتصالات عرضی در ترکیبات کلاژنی بیشتر بوده و کیفیت کلاژن موجود پایینتر است . - Brodsky, 1982 - از سوی دیگر، عروس دریایی با چتر کوچک دارای
