بخشی از مقاله
استخراج و خالص سازي لاکتوفرين خوراکي از آغوز شير و مقايسه غلظت آن با شير معمولي
چکيده
هدف : رژيم غذايي يک فاکتور محيطي کليدي مؤثر در شيوع بسياري از بيماريهاي حاد ميباشد. اخيرًا مشخص شده که تغذيه خوراکي لاکتوفرين اثرات مفيدي از جمله تعديل عملکرد سيستم ايمني، فعاليت ضد ميکروبي و آنتياکسيداني در سلامت انسان و حيوانات داشته است . اين مطالعه با هدف جداسازي و خالصسازي بهينه لاکتوفرين از آغوز شير گاو و مقايسه غلظت آن با شير معمولي انجام گرديد.
مواد و روشها: کلستروم شير گاو بلافاصله بعد از زايش و همچنين شير معمولي جمعآوري گرديد. ابتد چربي و سپس کازئين آنها جدا شد. سپس برخي از پروتئين ه اي شير با رسوبدهي از طريق آمونيوم سولفات جدا شدند. در مرحله بعد لاکتوفرين با استفاده از ستون کروماتوگرافي تبادل کاتيوني CM-Sephadex-C٥٠ با دستگاه FPLC جداسازي شد. براي شناسايي پروتيئن بدست آمده از روش الکتروفورز SDS-PAGE استفاده شد.
يافته ها: پروتئين لاکتوفرين خالص با وزن مولکولي با غلظت از کلستروم و با غلظت mg.ml 0.6 از شير معمولي بدست آمد. مرتبه خالصسازي براي لاکتوفرين آغوز و براي شير معمولي 20 بدست آمد.
استنتاج : با توجه به اهميت روز افزون کاربردهاي درماني، تغذيهاي، روش فوق علاوه بر سادگي و سرعت ميتواند باعث استحصال لاکتوفرين با خلوص بالا گردد. نتايج نشان ميدهد غلظت لاکتوفرين کلستروم بسيار بالاتر از شير معمولي است .
واژههاي کليدي: لاکتوفرين ، جداسازي، خالص سازي، کروماتوگرافي تبادل کاتيوني
مقدمه
لاکتوفرين يک گليکوپروتئين با وزن مولکولي 80 کيلودالتون ، عضوي از خانواده ترنسفرين و وابسته به پروتئينهايي است که توانايي اتصال و انتقال آهن را دارا ميباشد (1). لاکتوفرين يک آنتي اکسيدان است که آهنهاي آزاد را تسخير مينمايد و مانع از تشکيل راديکالهاي آزاد غير قابل کنترل ميشود. فعاليت ضد ميکروبي لاکتوفرين مربوط به پپتيد موجود در بخش آميني مولکول است که توسط پپسين موجود در اسيد معده شکسته ميشود و توليد لاکتوفريسين ميکند که فعاليت ضد ميکروبي قوي دارد (30).
غلظت لاکتوفرين در خون در طول مراحل عفونت ، التهاب و جذب بيش از اندازه آهن و اب رشد تومور افزايش مييابد.
با اين وجود غلظت لاکتوفرين موجود در پلاسما، خون و اي سرم در مقايسه با شير بسيار کمتر ميباشد . لاکتوفرين با اثر ممانعت شيميايي موجب کاهش سرطانزايي در حلق ، ريه ، زبان ، مثانه و کبد ميگردد. از ده مکانيسم شناخته شده عملکرد ي ممانعت شيميايي ترکيبات ضد سرطان ، لاکتوفرين به تنهايي 6 مورد از اين قابليتها را دارد از جمله : اثر آنتي اکسيدان ، ضد التهاب ، افزايش ايمني بدن ، ضد تکثير، ضد آنژيوژنز و کنترل انکوژن ميباشد (6 . تحقيقات پايه صورت گرفته در مورد لاکتوفرين ، اهميت شير مادر و سودمندي وجود لاکتوفرين در فرمول غذايي کودکان را نشان ميدهد. شواهد ديگري که تعيين کننده سودمندي لاکتوفرين در فرمول غذايي ميباشد از جمله بهبود فلور طبيعي روده ، افزايش فريتين سرم ، افزايش سطح هماتوکريت و کاهش بيماريهاي تنفسي ميباشد . علاوه بر اين لاکتوفرين مانع اکسيداسيون ليپيد در فرمول غذايي کودکان مي شود (2 . با توجه به ارزش پروتئين خوراکي دارويي لاکتوفرين ، گستردگي اثرات تنظيم کنندگي سيستم ايمني توسط آن ، همچنين ارزش خالص سازي لاکتوفرين و استفاده جهاني آن سبب شده که مطالعات گسترده در مورد اين پروتئين صورت گيرد. بنابراين خالص سازي پروتئين فوق در مطالعه حاضر، فرصتي براي بدست آوردن کاربردهاي جديد لاکتوفرين در حوزه پزشکي و دارويي خواهد بود.
مواد و روش ها
جداسازي لاکتوفرين از آغوز و شير معمولي گاو:
کلستروم شير گاو بلا فاصله پس از زايمان و همچنين شير معمولي گاو در ظروف استريل جمع آوري گرديد و در شرايط دمايي4 تا 6 درجه سانتيگراد نگهداري شد. سپس به مدت 10 دقيقه در دماي 4 درجه سانتيگراد و xg1000 سانتريفيوژ گرديد تا خامه آن ها جدا شود. بعد از جداسازي خامه ، به منظور جداسازي پروتئين کازئين ، با استفاده از HCl 2نرمال pH را به 6.4رسانده و به مدت 30 دقيقه در داخل بن ماري با دماي40 درجه سانتيگراد قرار داده شد. pH اسيدي و حرارت موجب رسوب کازئين ميشود. مجدداَ شير با شرايط قبلي سانتريفوژ شد، سوپرناتانت جمع آوري شده و رسوب کازئين دور ريخته ميشود . آب پنير اسيدي بدست آمده را اينبار توسط NaOH دو نرمال به pH برابر 8.6 رسانده و پس از آن سانتريفوژ با شرايط قبلي، جمع آوري مايع رويي و دور ريختن رسوب . مايع جمع آوري شده را به مدت 30 دقيقه در بن ماري با حرارت 65 درجه قرار داده تا پاستوريزه شود. جهت جداسازي گلوبولينها، به ازاي هر ليتر،267 گرم آمونيوم سولفات به آرامي افزوده شد و سپس به مدت 10 دقيقه در در 4 درجه سانتيگراد سانتريفيوژ گرديد. رسوب حاصل از پروتئين گلوبولين دور ريخته شد و به مايع رويي باقي مانده به ازاي هر ليتر به آرامي 250 گرم سولفات آمونيوم افزوده گرديد تا لاکتوفرينها رسوب نمايند. لاکتوفرينها ي رسوب کرده بوسيله سانتريفيوژ با شرايط قبلي جدا شدند و اينبار مايع رويي دور ريخته شد. به منظور جداسازي نمک سولفات آمونيوم از پروتئين ، عمل دياليز با استفاده از کيسههاي دياليز بامحدوده اندازه منافذ در دماي 10 درجه سانتيگراد و بر روي همزن با سرعت به مدت 24 ساعت در بافر فسفات 20 ميلي مولار انجام گرفت . سپس نمونهها جهت تغليظ بيشتر به مدت 24 ساعت در دستگاه فريز دراير قرار گرفتند تا لاکتوفرين به صورت پودر در آيد.
خالص سازي با استفاده از ستون کروماتوگرافي CM-Sephadex-C٥٠ در دستگاه FPLC:
PH ايزوالکتريک بالا (بيشتر از 9) در لاکتوفرين موجب ايجاد شارژ مثبت در PH خنثي در پروتئين ميگردد حال آن که در اين شرايط بيشتر پروتئينهاي شير اسيدي هستند. بنابراين ستون تبادل کاتيوني در pH خنثي روش معمولي براي جداسازي لاکتوفرين از آب پنير حاصل از شير است . براي خالص سازي لاکتوفرين از دستگاه FPLC(مدل LP بيورد آمريکا) استفاده شد تا ستونهاي آن در مقايسه با HPLC امکان بارگزاري مقادير بيشتر پروتيئن و استفاده از دامنه گسترده تر از بافرها را فراهم سازد. پروتئين لاکتوفرين با داشتن بار مثبت در انتهاي آميني به اين رزين متصل مي شود سپس با شيب غلظت نمک از آن جدا مي شود. براي اين منظور نمونههاي پودر شده پروتئين در بافر فسفات 20 ميلي مولار حل شده و سپس روي ستون CM-Sephadex-C٥٠ برده شد. ابتدا ستون با بافر فسفات 20ميلي مولار به تعادل رسيد سپس بعد از ورود نمونه ، پروتئين ها در شيب غلظت نمکي صفر تا0.5 مولار توسط بافر خروج که شامل بافر فسفات و NaCl يک مولار ميباشد از ستون با سرعت 0.75. ميلي ليتر در دقيقه خارج گرديد. پروتئين لاکتوفرين در مولاريته تا0.4و0.5 نمک ، خارج شد.
الکتروفورز در ژل پلي اکريل آميد در حضور سديم دودسيل سولفات (SDS-PAGE):
براي تاَييد خلوص لاکتوفرين بدست آمده از الکتروفورز SDS-PAGE استفاده شد (تانک الکتروفورز عمودي، ساخت شرکت بيورد BioRad . ژل SDS-PAGE دو قسمتي است . در بالا ژل متراکم کننده درصد و در پايين ژل جداکننده Running Gel 10 درصد تهيه شد. نمونههاي پروتئيني در حضور لاکتوفرين استاندارد در طول ژل تحت جريان الکتريسيته با ولتاژ 90 ولت و به مدت 1.5 ساعت حرکت نموده و پس از پايان الکتروفورز، ژل حاصل با رنگ کماسي بلو رنگ آميزي شده و پس از رنگ بري با محلول رنگ بر (اتانول +اسيد استيک ) باندهاي پروتئين آشکار گرديدند.
تعيين غلظت لاکتوفرين خالص شده با استفاده از روش برادفورد:
پس از اينکه نمونههاي لاکتوفرين آغوز و شير معمولي از دستگاه FPLC جمع آوري شد، بدين منظور غلظتهاي متفاوتي از استاندارد که پروتئين آلبومين سرم گاوي (BSA) است به مقادير 25،20،15،10،5،0 ميکروگرم تهيه شد. دو حجم متفاوت از غلظتهاي پروتئين خالص شده از آغوز و شير به ترتيب 5و25 ميکروليتر تهيه گرديد. خواندن جذب نمونه ها از زمان 10 دقيقه تا 1 ساعت در 595 نانومتر انجام گرفت و غلظت لاکتوفرين خالص شده با استفاده از منحني استاندارد به ست آمد.
نتايج
لاکتوفرين در غلظت نمکي (NaCl) 45-50 درصد از ستون خارج شده است . باند 80 کيلودالتوني پروتئين فوق درالکتروفورز SDS-PAGE با ژل آکريل آميد 40-50 درصد قابل مشاهده است و با لاکتوفرين استاندارد، قابل تاَييد مي باشد (شکل 1). مراحل خالص سازي و مرتبه خالص سازي لاکتوفرين آغوز و شير معمولي تعيين گرديد (جدول 1).
