بخشی از مقاله
بررسی اثرات محافظتی Ephedra pachyclada بر مدل حیوانی بیماری حاد کبدی القا شده با تتراکلرید کربن
چکیده
هدف: هدف از پژوهش حاضر بررسی اثرات محافظتی Ephedra pachyclada بر آسیب حاد کبدی ناشی از تتراکلریدکربن بود.
مواد و روشها: در این مطالعه ابتدا آزمایشی جهت دستیابی به مدل حیوانی استاندارد طراحی شد. در این آزمایش 03 سر مـوش بـه 3 گروه کنترل، شم و مدل تقسیم شدند. حیوانات گروه مدل 2 میلیلیتر بـر کیلـوگرم از تتراکلریـدکربن05 درصـد 1:1) در روغـن زیتـون استریل) را به صورت درون صفاقی دریافت کردند. 69 ساعت بعـد نمونـههـای خـون و کبـد حیوانـات جمـع آوری و مـورد بررسـیهـای بیوشیمیایی و بافتشناسی قرار گرفت. پس از اطمینان از صحت القای مدل در آزمایش دوم04 سر از موشها به 4 گروه تقسیم شدند، یک گروه به عنوان کنترل و 3 گروه دیگر به عنوان گروههای آزمایشی در نظر گرفته شدند. القای آسیب حاد کبدی به روش قبل در گروههای آزمایشی صورت گرفت با این تفاوت که دو گروه از آنها روزانه با عصاره 041) و 0041 میلیگرم بر کیلوگرم) تیمار شدند. نمونههای خون و کبد 69 ساعت بعد از تزریق تتراکلریدکربن جمع آوری شد. فعالیت سرمی آنزیمهـای آلانـین آمینـوترانس فـراز ()TLA و آسـپارتات - آمینوترانس فراز ()TSA در سرم و میزان نکروز و التهاب در کبد مورد بررسی قرار گرفت.
نتایج: تیمار با عصاره Ephedra pachyclada منجر به کاهش معنیداری در فعالیـت سـرمی ALT و AST ، نکـروز و التهـاب بـافتی و افزایش درصد بقا در حیوانات دریافت کننده تتراکلریدکربن شده است.
نتیجه گیری: نتایج تحقیق حاضر پیشنهاد میکند که Ephedra pachyclada با مهار استرس اکسیداتیو و سرکوب التهاب بافتی، کبد را در برابر آسیب حاد ناشی از تتراکلرید کربن محافظت میکند.
واژگان کلیدی: Ephedra pachyclada، آسیب حاد کبدی، تتراکلرید کربن
مقدمه
کبد ارگان مرکزی در متابولیسم و سم زدایی است. عملکردهـای متابولیکی و موقعیت استراتژیک کبد سبب شده این عضو هـدف توکسینهای گوناگون و مستعد بیماری های بسیاری باشـد .(1) بیماری کبدی به هرگونه شرایطی اطلاق می شود کـه منجـر بـه القای آسیب یا التهاب در بافت کبد شده و عملکرد کبد را متـاثر نماید. این بیماریها به دو دسته عمـدهی حـاد و مـزمن تقسـیم میشوند. بیماریهای حاد کبدی، فراوانی قابل توجهی ندارند بـه طوری که طبق آمار در ایالات متحده آمریکا میزان ابتلا بـه ایـن دسته از بیماریها 2000 مورد در سال است .(2) آنچه پرداختن به این بیماری را حایز اهمیت مـیکنـد مـرگ و میـر 80 تـا 94 درصد از افراد مبتلاست .(3) بیماری حاد کبدی در نتیجه نکروز حاد جمعیت کثیری از هپاتوسیتها و یا به دنبال آسـیب شـدید عملکرد هپاتوسلولار به طور کاملا ناگهانی ایجاد مـیگـردد 4)و .(5 عفونتها، توکسینها، مواد شـیمیایی و داروهـا، ایسـکمی و هیپوکسی کبدی و اختلالات متابولیکی مهمترین عوامل ایجـاد این نـوع از بیمـاریهـای کبـدی هسـتند .(6) در ایـن بیمـاری عملکرد سینتتیک کبد همچون گلوکـوژنز و تولیـد فاکتورهـای انعقادی، عملکرد دفعی کبد مثل ترشـح صـفراوی بیلـیروبـین و اسیدهای صفراوی و همچنـین عملکردهـای متابولیـکاش مثـل متابولیسم اوره دچار اختلال میشـوند .(5) انسـفالوپاتی کبـدی (Hepatic encephalopathy) نیز یکی از مهمترین نشانههـا در تشخیص این دسته از بیماریها است .(7) همان طور کـه گفتـه شد بیماری حاد کبدی با مرگ و میر قابل توجهی همـراه اسـت، داروها و درمانهای معمول تنها حدود 10 درصد از بیماران مبتلا را از مرگ نجات میدهد (5)، همین موضوع سبب شده است تـا برخــی از دانشــمندان علــوم داروشناســی پتانســیل فعالیــت هپاتوپروتکتیو را در گیاهان و بر پایه طب سنتی جسـتجو کننـد 8) و .(9
Ephedra Pachyclada (EP) گیـــــاهی از خـــــانواده Ephedraceae اســت. ایــن گیــاه بــه صــورت درختچــهای بــا ساقههای سبز، بند بند، پر شـاخه و معمـولا قـائم اسـت. EP در اقلــیم خشــک و نیمــه خشــک، خصوصــا در منــاطق کــویری و سنگلاخی جنوب و جنوب شرقی ایران میرویـد و بـه نـام هـای محلی هوم و ارمک شـناخته مـیشـود. شـهرت ایـن خـانواده از گیاهان به دلیل دارا بودن آلکالوئید های افدرینی فراوان است که مهمترین آنها افدرین و سودوافدرین هستند .(10) گیاهان ایـن
خانواده دارای خواص درمانی بسیاری بوده و هزاران سـال اسـت که در طب سنتی آسیای شرقی در درمان بیماریهای تنفسـی و آلرژیهـا کـاربرد دارنـد. اخیـرا نیـز در پزشـکی و در مقاصـدی همچون تخفیف درد، کاهش تب و کنترل وزن بدن مورد استفاده قرار گرفته اند 11)و .(12 مطالعاتی که روی بسـیاری از گیاهـان خانواده افدراسه انجام شـده مویـد خـواص ضـد التهـابی Anti-) (inflammatory و آنتیاکسیدانتی آنها اسـت. در سـال 2006 مطالعه عصـاره Ephedra sinica روی مـدل حیـوانی رماتوئیـد مفصلی نشان داد این گیاه قادر است با سرکوب التهاب بـه طـور قابل توجهی روند بیمـاری را مهـار کنـد .(13) در مطالعـهای در سال 2008،محققان حیوانات دارای آسیب حاد کبدیِ القا شـده با دی گالاکتوز آمین را با Mao (ترکیبی از عصاره گیاهـان ایـن خانواده) تیمار نمودند و نتایج حاکی از کاهش قابل توجه علایـم بیماری همچون نکروز بافتی، فاکتورهای سرمی و مرگ میر بـود .(14) مطالعهای که روی تعدادی از گونه هـای ایـن خـانواده در سال 2010 انجام شد نشـان داد کـه Ephedra Pachyclada حاوی مقادیر قابل توجهی ترکیبات فنلی و واجد خاصـیت آنتـی اکسیدانتی است .(15) تحقیقات مولکولی که در کشف مکانیسـم تاثیرات این گیاه صورت گرفته است، نشان داده که عصاره EP با کاهش واسطهگرهای التهابی مثـل Tumor necrosis ) 71)
(IDFWRU باعــث افــزایش فعــال ســازی ســیگنالینگ STAT3
(Signal transducer and transcription factor 3) و بــه دنبال آن سرکوب پاسخهای التهابی و کاهش آپوپتوزیس میشود .(16) با توجه به اینکه در آسیبهای حاد کبد، التهـاب بـافتی و استرس اکسیداتیو زمینه ساز نکروز گسـترده بـافتی و پیشـروی بیماری است، بر آن شدیم تاثیر عصاره این گیاه را بر بیماری حاد کبدی مورد مطالعه قرار دهیم.
انجام چنین مطالعاتی مستلزم ساخت مدل های حیوانی است که مقلد شرایط پاتوفیزیولوژیکیِ اختلالات کبدی باشند. طبق نظریه Terblanche و Hickman در یــک مــدل حیــوانی مناســب از بیماری حاد کبدی، آسیب ایجاد شده باید به طور بالقوه برگشت پذیر بوده، قابل تکرار باشد، مانند آنچه در شرایط کلینیکی اتفاق می افتد به مرگ منجر شود و بـین القـای مـدل و وقـوع مـرگ فرصت کافی جهت تست دارویی مورد نظـر وجـود داشـته باشـد .(17) در ایــن مطالعــه ســعی شــده اســت بــا اســتفاده از هپاتوتوکسینی شناخته شده به نام تتراکلریدکربن (CCl4) ابتدا مدل تایید شدهای از بیماری حاد کبدی ساخته شود و سپس بـا
تیمار حیوانات بیمار با عصاره EP چگونگی تاثیرات این گیـاه بـر روند بیماری حاد در کبد مورد بررسی قرار گیرد.
مواد و روشها
حیوانات: در این مطالعه تجربی، موشهای نر و بـالغ نـژادSW1 8) هفته) از انستیتو پاستور ایران خریداری شـدند. مـوشهـا در اتاق حیوانات با دمای کنترل شـده 23-2 سانتـــیگـراد و دوره نوری 12 سـاعت روشنایی و 12 ساعت تاریکی نگهداری شدند و آب و غذای کافی همواره در دسترس آنها قرار داشت. آزمایشها روی تمامی گروهها مورد بررسی در شرایط کاملا یکسان و مطابق اصول اخلاقیِ کار با حیوانات آزمایشگاهی صورت گرفت.
ساخت مدل حیوانی: جهت دستیابی به مدل حیوانی استاندارد، تعداد 30 سر موش بـه 3 گـروه 10 تـایی کنتـرل، شـم و مـدل تقسیم شدند. برای القـای آسـیب حـاد کبـدی Merck- CCl4 50 (Schuchardt, 2221) درصد (به نسبت 1:1 با روغن زیتون استریل شده) به میزان 2 میلیلیتر بر کیلوگرم وزن بدن در یـک دوز منفرد به صورت درون صفاقی به حیوانات گروه مدل تزریـق شد. حیوانات گروه شم تنها 2 میلیلیتر بر کیلوگرم روغن زیتون دریافت کردند و گروه کنترل هیچ تیماری را دریافت نکرد. میزان زندهمانی یا بقای حیوانات تا 96 ساعت بعد از تزریق مورد بررسی قرار گرفت. 96 ساعت بعد از تزریق حیوانات پس از وزن شدن با تزریق محلول کتامین Ketamin 10%-Alfasan, Woerden-) (Holland و زایــلازین (Xylasine 2% Alfasan Woerden-
Holland) بیهوش شدند. تحت شرایط بی هوشی خونگیری از قلب انجام شد و سپس کبد جهت آزمایشها بافت شناسی خارج و در فرمالین 10 درصد فیکس شـد. آنـالیز مارکرهـای سـرمی و مطالعات بافت شناسی جهت بررسی صحت القای مدل انجام شد. چگونگی انجام این بررسیها در ادامه ذکر شده است.
تهیه عصاره :EP روش عصـاره گیـری انتخـاب شـده در ایـن تحقیق بر اساس روش استفاده بومیـانِ منـاطق جنـوبی و غربـی ایران با اندکی تغییر می باشد؛ بدین ترتیب که سـر شـاخههـای تازه گیاه از حاشیه شهرستان فسا در استان فارس جمـع آوری و پس از کوبیدن در آب جوشـانده شـد. پـس از جوشـاندن اولیـه عصاره خارج شده از صافی رد شده و سپس محلول صاف شده با جوشاندن بیشـتر تغلـیظ گردیـد .(13) در ایـن آزمـایش جهـت دستیابی به غلظتهای مورد نظر، عصاره نیمه جامد بدست آمده
به میزان مورد نیاز وزن و سپس در آب مقطر حـل شـد؛ آن گـاه محلول نهایی با استفاده از فیلتر 0/2 میکرونی استریل گردید.
تیمار حیوانات دارای آسیب حـاد کبـدی بـا :EP پـس از اطمینان از صحت القای مدل، جهت بررسی تاثیر عصاره EP بـر روند بیماری حاد کبدی 40 سر موش به 4 گروه 10 تایی تقسیم شدند. یک گروه بعنوان کنترل و 3 گروه دیگر بعنوان گـروههـای تجربی در نظر گرفته شدند. حیوانات هر 3 گروه تجربی CCl4 را به همان اندازه آزموده شـده در مـدل سـازی 2) میلـیلیتـر بـر کیلوگرم (CCl4 به صورت درون صفاقی دریافت کردنـد. از میـان گروههای تجربی که القای بیماری در آنها صـورت گرفـت، یـک گروه به عنوان شاهد و دو گروه دیگر به عنوان گروه های تیماری در نظر گرفته شدند. به گروههای تیماری 2 ساعت بعد از دریافت CCl4 بـه ترتیـب 140 و 1400 میلـیگـرم از EP بـه ازای هـر کیلوگرم وزن حیوان به صـورت درون صـفاقی تزریـق شـد. ایـن تزریق هر 24 ساعت یک بار تکرار شد. وزن حیوانـات در ابتـدا و انتهای آزمایش به طور دقیق اندازه گیری و میـزان مـرگ و میـر حیوانات در طول آزمایش ثبـت شـد. 96 سـاعت بعـد از تزریـق CCl4 حیوانات با مخلـوط کتـامین- زایلازیـن بیهـوش شـدند و خونگیری از قلب تحت بیهوشی انجام گرفت. سپس کبد خـارج شده و پس از انـدازه گیـری دقیـق وزن در فرمـالین 10 درصـد فیکس شد.
مطالعات بافت شناسی: نمونـههـای بـافتی مطـابق روشهـای معمول پردازش شده و پس از قالبگیری با پارافین، برشهایی با ضخامت 4 تا 6 میکرون از آنها تهیه شد. اسلایدهای تهیه شـده با دو روش هماتوکسیلین و ائوزین (H&E) (جهت بررسی میزان نکروز) و رتیکولین (جهت بررسی داربست کبد) رنـگ آمیـزی و مورد بررسی قرار گرفتند. دراسلاید هـای H&E میـزان نکـروز بافتی با استفاده از استانداردهای تعیین شده در مطالعـات قبلـی مطابق با جدول شماره 1 کمـی شـد .(18) تعـداد سـلول هـای آماسی همچون نوتروفیـل و کـوپفر و لنفوسـیت در اسـلایدهای H&E بــا میکروســکوپ نــوری و بــا بــزرگنمــایی 400× مــورد شمارش قرار گرفتند. این شمارشها در دو میدان دید تصادفی از ده مقطعِ هر کبد صورت گرفت. لازم به ذکر است که از هر گروه
اسلایدهای مربوط به کبد شش موش مورد بررسی قرار گرفت.
آزمونهای بیوشیمیایی سرم: خون گرفته شده از حیوانات به مدت یک ساعت در دمای اتاق نگهداری و سـپس در 1500 gبـا دمای 4 درجه سانتیگراد بـه مـدت 10 دقیقـه سـانتریفوژ شـد
.(19) از سرم بدست آمده، آنزیمهای آلانـین آمینـو تـرانسفـراز (ALT) و آسپارتات آمینو ترانسفـراز (AST) کـه از مهـمتـرین مارکرهای سرمی آسیب کبدی هستند با اسـتفاده از کیـتهـای تولیدی شرکت پارس آزمون به وسیله اتوماتیک آنالیزر در طـول موج 340 نانومتر اندازه گیری شدند.
آنالیزهای آماری: نتایج بـه دسـت آمـده بـه وسـیله نـرمافـزار SPSS16 و آزمـون واریـانس یـک طرفـه بـا تسـت Post Hoc Tukey بــا ســطح معنــیداری (P<0/01) آنــالیز و بــه صــورت میانگین SEM ارایه شدند.
جدول :1 نحوه امتیاز دهی به اسلایدهای بافتی برای تعیین میزان درجه نکروز :(18)
درجه نکروز
0 نکروزی دیده نمیشود.
1 گروههای کوچکی از هپاتوسیت درگیر نکروز مرکزی شدهاند.
2 نکروز سانتریلوبولار کامل در کمتر از 1/4 لوبولهای کبد دیده میشود.
3 نکروز سانتریلوبولار کامل در بیشتر از 1/4 لوبولهای کبد ودر کمتر از نصف لوبها دیده میشود.
4 نکروز کامل تقریبا بیشتر از نصف لوبولهای کبد را در گیر کرده است.
نتایج
بررسی صحت القای مدل حاد کبدی
مطالعات داروشناختی روی بیماریهای کبدی نیازمند دسـتیابی بــه مــدل هــای حیــوانی اســتانداردی اســت کــه مقلــد شــرایط پاتوفیزیولوِژیک بیماری باشند، از این رو در ایـن مطالعـه جهـت اطمینان از صحت القای مدل، آزمایشی مطابق آنچه در روش کار ارایه شد طراحی گردید. نتایج نشان دادند که تیمار حیوانـات بـا یک دوز 2 میلیلیتر بـر کیلـوگرم از CCl4 باعـث افـزایش قابـل توجه AST و ALT سرمی نسبت به گـروههـای شـم و کنتـرل شده است (شکل 1، A و .(B این نتایج حاکی از القای آسیب بـه غشای هپاتوسیتها و آزادسازی ایـن آنـزیمهـا بـه خـون اسـت. مطالعــات بافــت شناســی کبــد نیــز حــاکی از نکــروز گســترده هپاتوسیتها و ارتشاح سلولهـای التهـابی حـول رگ مرکـزی و فضاهای بین لوبولی در حیوانات گروه مدل بود (شـکل 1، .(E در حالی که بافت کبد در دو گروه کنترل و شم کاملا طبیعی به نظر میرسید و هیچ نکروزی دیده نشد (شکل 1، C و .( D بـا توجـه به مطالعات گذشته در القای مدل حاد کبـدی، نتـایج مـا نشـان دادند این میزان از CCl4 میتواند مدل مناسبی از بیمـاری حـاد کبدی را القا نمایند و به عبارتی یافتههای ما موید صـحت رونـد مدل سازی انجام شده بودند. از این رو با القای بیماری بـه روش آزموده شده در مدل سازی و تیمار حیوانات بیمـار بـا EP تـاثیر این گیاه بر بیماری حاد کبدی بررسی شد.
تاثیر تیمار با EP بر بقا و وزن نسبی کبد حیوانات بعـد از تیمار با CCl4
بیماریهای حاد کبدی با مرگ و میـر بـالایی همـراه هسـتند و افزایش شانس بقا و به تاخیر انداختن مرگ در بیماران مبتلا بـه این آسیبها میتواند احتمال بازسازی کبد با روشهای درمـانی مختلف را افزایش دهد (5)، از این رو بررسی بقا و مـرگ و میـر حیوانات مورد آزمایش بسیار حایز اهمیت است. در این مطالعه با تزریق 2) میلیلیتر یر کیلـوگرم (CCl4، تعـدادی از مـوشهـای گروههای مـورد آزمـایش بـه دلیـل نقـص شـدید و ناگهـانی در عملکرد کبدی مردند. میزان و زمان مـرگ و میـر مـوشهـا در تمامی گروهها مورد بررسی قرار گرفت. در حیواناتی که علاوه بـر CCl4، EP را در دوزهای 140و 1400 میلـیگـرم بـر کیلـوگرم دریافت کردند مرگ و میر به طور وابسته بـه دوز کـاهش یافـت. بطوری که در گروه تیمار شده با 1400 میلیگرم بـر کیلـوگرم EPبیش از 50 درصد و در گروه تیمار شده با 140 میلیگرم بـر کیلوگرم EP بیش از 60درصدِ حیوانات زنده ماندنـد و ایـن در حالی بود که هیچ یک از حیوانات گروهی که فقط CCl4 دریافت کردند تا پایان 96 ساعت زنده نماند (شکل 2، .(A نتـایج حـاکی است که تیمار حیوانات مسموم با EP میتواند مرگ و میر ناشی از CCl4 را به طور معنیداری کـاهش و در نتیجـه درصـد بقـا را افزایش دهند. افزایش وزن کبد و وزن نسبی کبد به دلیـل تـورم سیتوتوکسیک سلولها از علایم بیماریهای کبدی است. در این مطالعه وزن نسبی کبد با اندازهگیری دقیق وزن بدن و وزن کبـد حیوانات در تمامی گروهها محاسبه شد. نتـایج نشـان دادنـد کـه
تیمار حیوانات با دوز بالاتر 1400) EP میلیگـرم بـر کیلـوگرم) افزایش وزن نسبی القا شده بـا CCl4 در کبـد را بـه طـور قابـل توجهی تخفیف داده است. کاهش وزن نسبی کبـد در گروهـی از
حیوانات که با دوز پایین تر 140) EP میلـیگـرم بـر کیلـوگرم) تیمار شده بودند نیز مشاهده شد ولی این کاهش از نظـر آمـاری معنی دار نبود (شکل 2، .(B
E C D
شکل :1 بررسی صحت القای مدل حاد کبدی با تزریق 2 میلیلیتر بر کیلوگرم تتراکلریدکربن A .(CCl4)، :B انـدازهگیـری ALT و AST سـرمی؛ CCl4 باعث افزایش معنیدار سطوح این آنزیمها در خون شده است. P< 0/01 میـزان معنـیداری اخـتلاف از گـروه کنتـرل و *P<0/01 میـزان معنـی داری اختلاف از گروه CCl4 را نشان می دهند. C و :D فتومیکروگراف از بافت کبد به ترتیب در گروه های کنترل و شـم. بافـت کبـد در ایـن گـروههـا کامـل طبیعی است، طنابهای کبدی کاملا منظم هستند؛ :E فتومیکروگراف از بافت کبد در گروه CCl4، نکروز حاد هپاتوسیتی و تجمـع سـلولهـای التهـابی (پیکان سیاه) و القای بی نظمی در طناب های کبدی مشهود است. (رنگآمیـزی هماتوکسـیلین و ائـوزین بـزرگنمـایی 200×،: CV سـیاهرگ مرکـزی. :CCl4: تتراکلرید کربن؛ :ALT آلانین آمینوترانس فراز؛ :AST آسپارتات آمینوترانس فراز).
شکل :A :2 تاثیر EP بر درصد بقای حیوانات بعد از تیمار با تتراکلریدکربن (CCl4)؛ EP منجر به افزایش بقای حیوانات در گروههای تحت تیمار شده است. :B تاثیر EP بر وزن نسبی کبد (وزن کبد100 / گرم وزن بدن) در حیوانات تیمار شده با CCl4؛ EP منجر به کاهش معنی دار وزن نسبی کبد در حیوانات تحت تیمار با دوز 140 میلیگرم بر کیلوگرم شده است. P< 0/001 میزان معنی داری اختلاف از گروه کنترل و *P<0/001 میزان معنی داری اختلاف از گروه CCl4 را نشان میدهند. تعداد حیوانات در هر گروه 10 سر است Ephedra pachyclada :EP)، :Low EP غلظت پایین عصاره EP معادل 140 میلیگرم بر کیلوگرم ، :High EP غلظت بالای عصاره EP معادل 1400 میلیگرم بر کیلوگرم ، :CCl4 تتراکلرید کربن).
تاثیر EP بر فعالیت AST و ALT سرمی بعد از تیمـار بـا
CCl4
AST و ALT از مهمترین شاخصهای پاتولوژیک مرگ سلولی و آسیب در کبد هستند .(20) در این مطالعـه آنـالیز بیوشـیمیایی این آنزیم ها در سرم جمع آوری شده از حیوانات انجـام گرفـت. نتایج نشان دادند که تزریق درون صفاقی 2 میلیلیتر بر کیلوگرم CCl4 باعث افزایش قابل توجهی در فعالیـت سـرمی آنـزیمهـای AST و ALT شده است، ولی تیمـار حیوانـات دریافـت کننـده همــین میــزان CCl4 بــا دوز هــای 140و 1400 میلــیگــرم بــر کیلوگرم EP میـزان فعالیـت سـرمی ایـن آنـزیمهـا را بـه طـور معنیداری کاهش داده است (p<0/01) (شکل.(3 لازم بـه ذکـر است که میانگین سطوح AST در گروههای تیمـار شـده بـا EP بطور وابسته به دوز کاهش یافـت در حـالی کـه در مـورد ALT حیوانات تیمار شده با دوز 140 میلیگرم بر کیلوگرم EP کاهش بیشتری در سطوح این آنزیم نشان دادند، اگرچه تفـاوت بـین دو گروه تیمار شده با EP در مورد هیچکـدام از دو آنـزیم معنـیدار نبود. نتایج حاکی از این اسـت کـه EP مـرگ سـلولی و آسـیب کبدی القا شده با CCl4 را بـه طـور قابـل تـوجهی کـاهش داده است.
