بخشی از مقاله
مقدمه
امروزه گسترش بسیاري از بیماريها ازجمله بیماريهاي دستگاه گوارش، دیابت و سیروز کبدي در جوامع انسانی خطري جدي قلمداد میشود. دانشمندان از گذشته تا به حال بهدنبال راههاي مؤثر براي درمان اینگونه بیماريها بودهاند و به موفقیتهاي چشمگیري دست یافتهاند. در سالهاي اخیر، سلولدرمانی به منزله روشی مؤثر براي درمان بسیاري از بیماريها هدف توجه قرار گرفته است. سلولهاي بنیادي جنینی، سلولهاي بنیادي مغز استخوان، سلولهاي بنیادي خون بند ناف و برخی سلولهاي بنیادي آندودرمی و اکتودرمی به مثابه گزینههایی براي درمان این بیماريها پیشنهاد شدهاند. سلولهاي جنینی بهعلت امکان رد پیوند، مشکلات اخلاقی و امکان تولید تومور در بدن فرد دریافتکننده وهمچنین سلولهاي بنیادي مغز استخوان بهدلیل محدودیتهاي مختلف ازجمله تبدیل به سلول استئوکلاست، ازدستدادن قدرت تمایز در سنین بالا، تولید جمعیت سلولی بسیار متنوع و غیره گزینه هاي مناسبی به شمار نمیآیند (Sethe et al., 2006; Lu et .al., 2006) بهدنبال بحث تولید سلولهاي iPS
(Induced pluripotent stem cells) از سلولهاي تمایزیافته بالغ توسط Yamanaka دریچه جدیدي از امید براي بهکار بردن سلولهاي بنیادي در درمان بیماريها
بدون نگرانی از وجود مشکلات دستگاه ایمنی و مسائل اخلاقی باز شده است (Maruyama et al., 2013;
.Yamanaka, 2009)
سلولهاي iPS سلولهاي بنیادي پرتوانی تلقی میشوند که به طور آزمایشگاهی از سلولهاي غیربنیادي بالغ به دست میآیند (Noguchi, 2009; Kim et al., . 2008b) بدینصورت که ژنهاي القاکنندهاي که شامل ژنهاي خانوادههاي Oct، Sox، Klf و Myc هستند با کمک روشهاي مختلف مثل استفاده از سیستم لنتی-ویروس وارد سلولهاي بالغ میشوند (Takahashi &
.Yamanaka, 2006) سلولهاي iPS توانایی خودنوزایی و تمایز به انواع سلولهاي بدن انسان را دارند و از بسیاري جهتها ازجمله مورفولوژي، سرعت تکثیر، فعالیت تلومرازي و بیان انواع ژنهاي پرتوانیکاملاً، مشابه سلولهاي بنیادي جنینی عمل میکنند ( Zaehres & .(Scholer, 2007 امروزه محققان به این مهم دست یافتهاند که تمایز سلولهاي بنیادي پرتوان به سلولهاي آندودرم قطعی اولین و مهمترین مرحله در تمایز سلولهاي بنیادي به سلولهایی مانند سلولهاي پانکراسی یا هپاتوسیتی است .(Sherwood et al., 2007) آندودرم قطعی منشأ دودمانهاي سلولی اپیتلیالی است که برخی مسیرهاي تنفسی و گوارشی را ایجاد میکند و منشأ
یافتههاي نوین در علوم زیستی، جلد 8- 22 :1
تیروئید، تیموس، ششها، کبد و پانکراس نیز هست .(D'Amour et al., 2005) آندودرم قطعی در طول مرحله گاسترولاسیون جنینی تشکیل میشود، فرآیندي که سلولهاي پرتوان اپیبلاستی درون تودة سلولی داخلی به سه لایه زایندة اولیه تقسیم میشوند. سلولهاي اپیبلاستی یکی از دو نوع سلولهایی هستند که در تودة داخلی وجود دارند و منشأ بافتهاي جنینی میگردند. دسته دیگر سلولهاي هیپوبلاستی هستند که منشاء بافتهاي خارج جنینی مثل آندودرم احشایی و آندودرم محیطی میشوند که در تشکیل حفرههاي جنینی شرکت میکنند، اما شواهدي براي شرکت آنها در تکوین بافتهاي جنینی وجود ندارد .(Zhou et al., 2008)
آغاز گاسترولاسیون با ظهور خط اولیه تعیین میشود؛ جایی که سلولهاي اپیبلاستی از آنجا وارد و ازحالت اپیتلیالی به مزانشیمی تبدیل میشوند تا آندودرم قطعی یا مزودرم را ایجاد کنند. مطالعات نشان میدهد که این سلولها از پیشسازهاي مشترکی تکوین مییابند که در-واقع سلولهاي حد واسطی محسوب و مزواندودرم نامیده میشوند .(Hansson et al., 2009) بعد از آشکارشدن اهمیت تولید سلولهاي آندودرم قطعی، پروتکلهاي مختلفی براي القاي انواع سلولهاي بنیادي به سلولهاي اندودرم قطعی با استفاده از انواع سیگنالینگهاي مولکولی مطرح شد. ازجمله رایجترین و مؤثرترین فاکتورهاي القاکننده میتوان به Activin A با غلظتهاي بالا و Nodal اشاره کرد ( Kroon et al., 2008; McLean et al., 2007; D'Amour et al., 2006) که ازطریق فعالکردن مسیرهاي Smad عمل میکنند و سبب القا سلولهاي آندودرم قطعی با کارایی بالا میشوند .(Mfopou et al., 2010) یکی دیگر از فاکتورهاي مؤثر،که امروزه در القاي سلولهاي آندودرم قطعی استفاده
10 Nova Biologica Reperta 1: 8 -22 (2015)
10/
میشود، ریزمولکولی با عنوان IDE1 مخفف Induced definitive endoderm میباشد که بهدلیل مزیتهایی که نسبت به عوامل دیگر دارد مرکز توجه است. مطالعات اخیر نشان داده که IDE1 نیز ازطریق فعالسازي مسیر Smad عمل میکند .(Borowiak et al., 2009)
در سالهاي اخیر، مهندسی بافت به منزله یک رشته-اي آکادمیک فرصت بینظیري را براي پیشرفت و بهبود روشهاي درمانی جهت درمان بیماريهاي مادرزاد و اکتسابی فراهم کرده است .(Serra et al., 2013) مطالعات نشان میدهد استفاده از داربست نقش مؤثري در تمایز سلولهاي بنیادي به انواع مختلف سلولها دارد و سبب افزایش بقا و تکثیر آنها میشود. وضعیت کشت سهبعدي در مقایسه با کشت دوبعدي به وضعیت تکوین در in vivo شبیهتر است. داربستهاي نانوفیبروز با تشکیل شبکهاي از الیاف بهمتنیدهشده با منافذ فراوان، فضایی شبیه به ماتریکس خارج سلولی بدن براي سلولها فراهم میسازد که بر مورفولوژي، جهتگیري، چسبندگی، مهاجرت، تکثیر، تمایز و عملکرد سلولها مؤثر است .(Hosoya et al., 2012) امروزه استفاده از داربستهاي مصنوعی بهعلت مزیتهاي فراوان ازجمله انعطافپذیري و قیمت مناسب بهشدت درحال گسترش است
.(Domingos et al., 2013; Meng et al., 2006) ازجمله مهمترین و معمولترین داربستهاي بهکاررفته میتوان به PLA, PCL, PGA و PLGA اشاره کرد
(Chao et al., 2009; Kim et al., 2008; Pham et . al., 2006) هدف این تحقیق بررسی توان تمایز
سلولهاي hiPS در محیط کشت سهبعدي به سلولهاي آندودرم قطعی با استفاده از IDE1 بهوسیله بررسی مارکرهاي آندودرمی بوده است.
یافتههاي نوین در علوم زیستی، جلد 8- 22 :1
مواد و روشها
کشت سلولهاي hiPS
سلولهاي hiPS به صورت معمول بر روي سلولهاي فیبروبلاست موشی، که یک لایه سلولی تغذیه کننده
محسوب میشوند، در محیط کشت DMEM/F12
(Gibco) حاوي 10٪ Serum Knock Out
(SR, Gibco) Replacement، 5٪ Fetal Bovine (FBS, Gibco) Serum، ال-گلوتامین با غلظت 2 میلیمولار (Gibco)، بتامرکاپتواتانول (Gibco) با غلظت 1/1 میلیمولار، اسیدهاي آمینه ضروري (Sigma) با غلظت یک میلیمولار، پنیسیلین 1٪ (Gibco) و (Gibco) bFGF با غلظت 10 ng/ml در فلاسک کشت داده شدند. محیط کشت سلولی بهصورت روزانه تعویض ومعمولاً بعد از 8 روز با استفاده از کلاژناز نوع چهار (Sigma) با غلظت 1 mg/ml پاساژ داده شدند.
تمایز سلولهاي hiPS به سلولهاي آندودرم قطعی
بعد از این که حدود 80٪ فلاسک پر شد، سلولها پاساژ و از سلولهاي تغذیهکننده جدا شدند و حدود 5×104 سلول در ظروف ششخانه نچسب به مدت 2 تا 4 روز همراه با محیط کشت کامل قرار داده شدند تا اجسام جنینی (EBs) شکل بگیرند. سپس سلولها با محیط کشت DMEM/F12 حاوي 10٪ SR، 5٪ FBS، ال-گلوتامین با غلظت 2 میلیمولار، بتامرکاپتواتانول با غلظت 1/1میلی مولار، اسیدهاي آمینه ضروري با غلظت یک میلیمولار، پنیسیلین 1٪ و ماتریژل 1 (R&D)٪ بر روي داربست قرار گرفتند و 24 ساعت بعد این محیط با محیط کشت تمایزي DMEM/F12 حاوي 0/2٪ SR، الگلوتامین با غلظت 2 میلیمولار، بتامرکاپتواتانول با غلظت 1/1 میلیمولار، اسیدهاي آمینه ضروري با غلظت یک میلیمولار، پنیسیلین 1٪ و (Stemgent) IDE1 با
11 Nova Biologica Reperta 1: 8 -22 (2015)
11/
غلظت 1 µM جایگزین شد. محیط تمایزي هر 48 ساعت یکبار تعویض و سلولها بهمدت یک هفته در این وضعیت نگهداري شدند.
تهیه داربست نانوفیبري با روش الکترواسپینینگ
براي تهیه داربست ابتدا پلیمر (Sigma) PCL با غلظت 10٪ در حلال کلروفورم در دماي اتاق به مدت 24 ساعت حل شد تا محلولی شفاف بهدست آمد. سپس محلول در سرنگ پلاستیکی 5 میلیلیتري قرار گرفت و در دستگاه الکترواسپینینگ جاسازي شد. براي اسپین این محلول از سوزن 22 gauge استفاده شد. ولتاژ بین 12 تا 14 کیلوولت، سرعت تزریق 0/5 میلیلیتر در ساعت، فاصله سر سوزن تا غلتک 10 سانتیمتر و سرعت چرخش غلتک 1000 rpm تنظیم شد. این محلول به مدت 15 ساعت روي ورقه الومینیومی اسپین شد و سپس اسکافولد حاصل بهمدت 24 ساعت در خلأ خشک شد.
کشت سلولهاي hiPS بر داربست
بعد از تهیه، داربست به قطعاتی با قطر 16 میلیمتر تقسیم و براي استریلشدن به مدت 24 ساعت درمقابل تابش امواج UV قرار داده شد؛ سپس در پلیت 24 خانه تعبیه و بهمدت 24 ساعت در PBS محتوي غلظت بالاي پنیسلین-استرپتومایسین قرار گرفت. سپس تعداد 5×104 cell/well سلول در هر خانه ریخته شد و براي افزایش چسبندگی سلولی از غلظت 1٪ ماتریژل استفاده شد و 24 ساعت بعد محیط تمایزي اضافه گردید.
بررسیهاي مورفولوژي با میکروسوپ الکترونی
مورفولوژي، قطر و منافذ الیاف تهیهشده و همچنین چگونگی آرایش سلولی بر داربست با میکروسکوپ الکترونی (SEM) بررسی شد. براي آمادهسازي نمونه
TaqMan Reverse
یافتههاي نوین در علوم زیستی، جلد 8- 22 :1
اسکافولدهاي داراي سلول ابتدا نمونهها با PBS بهمدت پنج دقیقه شسته شد و سپس با گلوتاردهید 2/5٪ به مدت یک ساعت تثبیت و سپس آبگیري با الکلهاي 30٪، 50٪، 70٪، 80٪، 90٪، 100٪ به صورت صعودي هر کدام پانزده دقیقه انجام گرفت. سپس با ذرات طلا پوشانده شد و عکسبرداري با میکروسکوپ الکترونی SEM انجام گرفت. قطر الیاف و اندازة منافذ با استفاده از نرمافزار Measurement اندازهگیري شد.
ارزیابی میزان بقاي سلولی با روش MTT
میزان بقاي سلولهاي کشتدادهشده روي داربست نانوفیبروز در مقایسه با محیط کشت دوبعدي (محیط تمایزي کشت دوبعدي کاملاً مشابه محیط تمایزي کشت سهبعدي است و فقط در این مرحله داربست وجود ندارد) با استفاده از MTT با غلظت 5 mg/ml ارزیابی شد. این آزمون در روزهاي 1، 3 و 5 بعد از قراردادن سلولها در محیط کشت دوبعدي و سهبعدي انجام شد. به این صورت که در زمان مناسب بعد از کشت سلولها در پلیتهاي 24 خانه، محیط کشت خارج و به هر خانه حدود 300 میلیلیتر محیط تازه حاوي 30 میکرولیتر از محلول MTT اضافه شد. بعد از 3 تا 4 ساعت انکوباسیون با دماي 37 درجه سانتیگراد محلول MTT خارج و به هر خانه 200 میکرولیتر DMSO (Dimethyl Sulfoxide) اضافه شد. سپس جذب نمونه در طول موج 570 با استفاده از دستگاه الیزا ریدر خوانده شد.
بررسی ایمونوسیتوشیمی
یکهفته بعد از تیمار، سلولهاي تمایزیافته با پارافرمالدهید 4٪ (PFA, Sigma-Aldrich) بهمدت 30 دقیقه تثبیت شدند. سپس با PBS شسته شدند و به وسیله TX-100 in 0/1 PBS (TBST)٪ نفوذپذیر و سپس به مدت یک
12 Nova Biologica Reperta 1: 8-22 (2015)
12/
ساعت در محلول بلوکینگ (5% BSA in TBST) قرار گرفتند. سپس بهمدت 12 ساعت در معرض آنتیباديهاي اولیه شامل (Santa cruz) Sox17، (R&D) Gsc و (Millipore) FoxA2 قرار گرفتند. در مرحله بعد سلولها تحت شستشو قرار گرفتند و سپس به مدت یک ساعت در مجاورت آنتیباديهاي ثانویه شامل Alexa
fluor 488 و (Gibco) Alexa fluor- 594 قرار گرفتند و بعد از شستشو، براي رنگآمیزي هستهها، با رنگ DAPI به مدت 5 دقیقه رنگآمیزي شدند.
استخراج RNA و انجام qRT-PCR
الگوي بیان mRNA ژنهاي مختلف درگیر در تکوین آندودرم قطعی با استفاده از qRT-PCR انجام شد. براي استخراج RNA سلولها با استفاده از Qiazol لیز شدند و
براي سنتز cDNA از
Transcription Kit (ساخت شرکت کیاژن، ژاپن) استفاده شد. براي هر نمونه 40 نانوگرم از cDNA سنتز -
شده با 10 میکرولیتر از Power Syber Green master mix (ساخت شرکت کیاژن، ژاپن) و 0/5 میکرولیتر از هر پرایمر (جدول (1 مخلوط گشت. Ct هر نمونه با استفاده از نرمافزار StepOne محاسبه و نرمالیزاسیون با استفاده از ژن HPRT انجام گرفت و هر آزمایش سه بار تکرار شد.
بررسیهاي آماري
کنترل و آزمایش به صورت میانگین و انحراف از خطاي میانگین محاسبه شد و براي بررسی معنیدار بودن اختلاف بین گروهها از آزمون T و نرمافزار SPSS(Ver.12) استفاده شد و تفاوت p<0.05 معنیدار در نظر گرفته شد.
یافتههاي نوین در علوم زیستی، جلد 8- 22 :1
نتایج
بررسی مورفولوژي سلولهاي hiPS کشت داده شده بر داربست PCL
بررسی مورفولوژي داربست PCL و چگونگی استقرار سلولهاي hiPS بر داربست ازطریق عکسبرداري با میکروسکوپ الکترونی SEM انجام گرفت. میکروگراف الکترونی داربست نانوفیبروز PCL در شکل -1الف نشان
13 Nova Biologica Reperta 1: 8-22 (2015)
13/
داده شده است و متوسط قطر الیاف با نرمافزار Measurmentحدوداً 200 نانومتر تخمین زده شد (شکل-1ب). شکل 2 مبین چگونگی استقرار سلولهاي hiPS بر داربست PCL پوششدادهشده با ماتریژل بعد از 7 روز است که استقرار، بقا و تمایز سلولها بر داربست را نشان میدهد.
