بخشی از مقاله
چکیده
معضل ریشهدار کردن شاخسارههای درون شیشه ای، عامل محدودکنندهی بزرگی در ریزازدیادی مرکبات است. هدف از این پژوهش توسعهی پروتکل موثر ریشهزایی در شرایط in vitro در ریزشاخههای نارنج میباشد. در این پژوهش به منظور به دست آوردن شاخساره، ریزنمونههای اپیکوتیل و هیپوکوتیل نارنج در محیط MS حاوی - 2mg/l - BAP و mg/l - NAA - 0/2 کشت شدند و پس از باززایی به محیط کشت القای ریشه شامل محیط کشت MS حاوی غلظتهای مختلف NAA 2 mg/l - ،1،0/5، - 0 منتقل شدند. در پایان طول، قطر و تعداد انشعاب ریشه در هر شاخساره بررسی شد. به طورکلی ریشهزایی با استفاده از نفتالین استیک اسید افزایش یافت.
مقدمه
پروژههای اصلاح کلاسیک مرکبات از اواخر قرن نوزدهم تاکنون در حال انجام است. اما محدودیتهای خاص مرکبات نظیر دوره ی جوانی طولانی، سطح بالای هتروزیگوسیتی، خودناسازگاری و چند جنینی نوسلار، مانع از دستیابی به نتایج مطلوب در این مطالعات می شوند.
با ظهور تکنولوژیهای جدید از جمله روشهای مولکولی و تکنیکهای کشت بافت، افقهای جدیدی به روی محققان برای غلبه بر این محدودیتها و بهبود ژنتیک مرکبات باز شد. لذا روش های مبتنی بر کشت بافت گیاهی هم چون انتقال ژن با استفاده از مهندسی ژنتیک، به عنوان جایگزینی مناسب برای روش های اصلاح سنتی در دست بررسی است زیرا با استفاده از این روش ها می توان علاوه بر حفظ ویژگی های مطلوب یک رقم، یک صفت دلخواه را در دوره زمانی تا حدودی کوتاه تر به آن افزود.
در این بین مشکلات ریشه زایی در گیاهان باززایی شده جزء چند مشکل محدودکننده در پروتکل های حال حاضر مرکبات است . توسعه ی ریشه های نابجا پدیده ای پیچیده است که توسط مجموعه ای از عوامل درونی و محیطی کنترل می شود. تغییرات آناتومیک، فیزیولوژیک و مولکولی مختلفی در ارتباط با افزایش بازدهی ریشه زایی می باشد
اگرچه مکانیسم های مولکولی ایجاد ریشه هنوز ناشناخته مانده اما نقش محوری اکسین خارجی در این رابطه ثابت شده است. افزودن اکسین به محیط کشت اغلب مشکل ریشه زایی را در گیاهان چوبی که به سختی ریشه دار می شوند حل کرده است. فاز ریشه زایی با اضافه کردن مقادیر مختلف اکسین به محیط کشت آغاز می شود
اکسین طبیعی موجود در بافت گیاه ایندول استیک اسید است که به علت عدم پایداری در کشت بافت درختان مورد استفاده قرار نمی گیرد. از این رو از اکسین های مصنوعی استفاده می شوداثر. انواع اکسین های مصنوعی نیز، چه از نظر کمّی و چه کیفی یکسان نیست. در بین اکسین های مصنوعی مورد استفاده IBA و NAA به دلیل پایداری بیشتر اغلب موثرتر از IAA می باشد. مطالعات سوارز فیلیو و همکاران [8] - 2011 - که بر روی دو کلتیوار از پرتقال شیرین انجام شد، نشان داد که NAA در تمایز ریشه اهمیت دارد. در این تحقیق نیز سعی شده گامی در جهت رفع مشکلات ریشه زایی درون شیشه ای مرکبات برداشته شود.
مواد و روش ها
جهت تهیه ی ریزنمونه، میوه های تازهی نارنج تهیه شد. بذور نارنج از میوه های تازه و سالم خارج شده و پس از جدا کردن پوسته خارجی، ضدعفونی سطحی شدند. برای ضدعفونی، بذرها در محلول 2 درصد هیپوکلریت سدیم به همراه توئین با غلظت 1درصد به مدت 15 دقیقه به آرامی تکان داده شده سپس 3 مرتبه با آب استریل هر مرتبه به مدت 3 دقیقه شستشو شدند
.در ادامه بذور به مدت یک دقیقه در اتانل 70 درصد قرار گرفته و3 مرتبه با آب مقطر استریل آبکشی شدند. بذ رهای ضد عفونی شده به محیط جوانه زنی شامل نمک های کامل محیط کشت MS ، ویتامین های کامل MS، 30 گرم در لیتر ساکارز، 7 گرم در لیتر آگار pH=5/8 منتقل و برای مدت 4 تا 6 هفته در 27 - 1 درجه سانتی گراد در شرایط تاریکی نگهداری شدند. گیاهچه های اتیوله حاصل از بذور نارنج کشت شده در تاریکی، برای تهیه ی ریزنمونه ها استفاده شدند. ابتدا لپه ها، ریشه و برگ ها و ساقه های زاید جدا شده و سپس از گیاهچه ها ریزنمونه به طول تقریبی 1 سانتی متر تهیه شد.
در نهایت ریزنمونه ها به پلیت های حاوی نمک های کامل محیط MS ، 30 گرم در لیتر ساکارز ، 7 گرم در لیتر آگار و تنظیم کننده های رشد مربوط با pH= 5/8 منتقل شدند. تنظیم کننده های رشد مورد استفاده 2 میلی گرم در لیتر BAP و 0/2 میلی گرم در لیتر NAA بود. پس از 3 الی 4 هفته، ریزنمونه هایی که دارای جوانه هایی به طول 2 میلی متر شدند، به محیط رشد شاخساره شامل نمک های کامل محیط کشت MS، ویتامین های کامل MS ، 30 گرم در لیتر ساکارز ، 7 گرم در لیتر آگار، 1 میلی گرم در لیتر GA3 منتقل شدند.
پس از این که شاخساره های حاصل از باززایی ریزنمونه ها به اندازه ی حداقل 1 سانتی متر رسیدند، از ریزنمونه ها جدا شده و به محیط القای ریشه شامل نمک های محیط کشت MS، ویتامین های کامل MS ، 30 گرم در لیتر ساکارز و غلظت های مختلف 5 - NAA،1،0/2،0 میلی گرم در لیتر - منتقل شدند. به منظور استقرار شاخساره در محیط مایع از سیستم Raft culture استفاده شد. پس از حدود 6 هفته، طول ریشه، قطر ریشه و تعداد ریشه در هر شاخساره اندازه گیری شد. آزمایش ها در قالب طرحکاملاً تصادفی انجام شده و آنالیز داده ها با نرم افزارSAS 9/2 انجام گرفت.
شکل .1 استقرار گیاهچه در محیط MS مایع با استفاده از سیستم Raft culture
نتایج و بحث
در این پژوهش اثر سطوح مختلف NAA بر ریشه زایی شاخسارههای درون شیشهای نارنج مورد بررسی قرار گرفت. فقط شاخسارههایی به طول حدود 1 سانتی متر به محیط القای ریشه منتقل شدند. بر این اساس تاثیر افزایش غلظت NAA در این آزمایشات، ممانعت در تشکیل ریشه و افزایش کالوس زایی بود.
شکل.2 شاخساره های درون شیشه ای نارنج پس از القای ریشه توسط NAA
