بخشی از مقاله
چکیده:
امروزه با ایجاد آلودگیهای زیستمحیطی فراوان، تلاش زیادی برای یافتن روشهای بیولوژیکی به منظور تولید پلاستیکهای زیستتخریبپذیر صورت گرفته است. پلیهیدروکسیآلکانوات1 به خاطر خواص ترموپلاستیکی ویژه، بسیار مورد توجه هستند. بعضی از میکروارگانیسمها ازجمله باکتریها قادر به تولید و تجمع PHA در درون سلول خود هستند. در این تحقیق باکتریهای جداسازی شده از پساب نفتی پالایشگاه نفت کرمانشاه مورد بررسی قرار گرفت که دراین بین تنها یک نوع باکتری توانایی سنتز بیوپلیمر را داشت. این سویه باکتریایی با روشهای بیوشیمیایی و مولکولی از طریق تعیین توالی ژن 16srDNA با چندین باکتری از جنس Sphingobium شباهت بالایی نشان داد؛ بنابراین مشخص شد که این باکتری از نوع Sphingobium sp میباشد. آنالیزهای GC-mass, FTIR برای صحت تولید بیوپلیمر در این باکتری استفاده شد. میزان تولید بیوپلیمر در این باکتری در محیط حاوی گلوکز بهعنوان منبع کربن، 720 mg/l بود.
کلمات کلیدی: پلیهیدروکسی آلکانوات، پساب نفتی، میکروارگانیسم، منبع کربن
-1 مقدمه
با افزایش رشد جمعیت جهان مصرف پلاستیکها در زندگی روزمره افزایشیافته است، درنتیجه تجمع پلاستیک یک نگرانی اساسی در طبیعت است .[1] پلیهیدروکسیآلکانواتها - PHAs - استرهای هیدروکسی-آلکانواتها هستند که توسط تعدادی از باکتریها بهصورت ذخایر انرژی و کربن درون سلولی سنتز شده و بهصورت گرانول در سیتوپلاسم سلولها تجمع مییابند.[2] این نوع بیوپلیمرها میتوانند به سادگی از طریق شکست سلول و با استفاده از یک سیستم استخراج آبی با استفاده از حلالهای مشخص که سایر مواد سلولی مانند چربی، نوکلئیک اسید و پروتئینها را حذف میکنند، استخراج و خالصسازی شوند. .[3]
پلی هیدروکسی آلکانواتها محدوده گستردهای از کاربردها را با توجه به ویژگی زیستتخریبپذیری و استفاده از منابع تجدید پذیر دارند. این بیوپلیمرهامخصوصاٌ در حاملهای تجزیهپذیر داروهای با دوز کم در طولانی مدت، هورمون،حشرهکشها و آفتکشها استفاده شدهاند. آنها همچنین بهعنوان مواد استخوان مصنوعی به خاطر خاصیت پیزوالکتریکشان نیز استفاده شدهاند. از دیگر استفادههای درمانی آنها میتوان به بشقابکهای استخوانی، بخیه، و جایگزین رگهای خونی اشاره کرد.[4] تحقیقات نشان داده است که مقدار منبع کربن به تنهایی برای بیان نحوه تولید بیوپلیمر کافی نیست و لازم است تا عوامل متعدد دیگری نیز در این زمینه مورد بررسی قرار گیرند.
در این ارتباط نسبت بین منابع کربن و نیتروژن - C/N - توانسته تا حدود بیشتری رشد میکروارگانیسم و شکل-گیری بیوپلیمر را بیان کند.[5] محتوای پلیهیدروکسیآلکانواتها برحسب منبع کربن و نوع میکروارگانیسم مورد استفاده، متفاوت بوده و بین 40 تا بیش از 80 درصد وزن سلول متغیر است. یکی از متداولترین منابع برای تولید پلیهیدروکسیآلکانواتها گلوکز است. دریکی از مطالعات با استفاده از میکروارگانیسم Alcaligenes eutrophus در محیط کشتی حاوی گلوکز به تولید بیوپلیمر دست یافتند که تمامی بیوپلیمر تولید هیدروکسیبوتیرات بودkoller .[6] و همکاران با استفاده از Pseudomonas hydrogenovora and Hydrogenophaga اقدام به تولید پلی هیدروکسی بوتیرات ووالرات از لاکتوز آبپنیر نمودند.[7]
-2 مواد و روشها
-1-2 جداسازی گونه میکروبی
در این تحقیق گونههای میکروبی موجود در پساب پالایشگاه نفت کرمانشاه، مورد بررسی قرار گرفتند. نمونههای پساب تحت شرایط استریل به آزمایشگاه منتقل شدند. جهت جداسازی گونههای میکروبی یک قطره از پساب را با آب مقطر استریل، رقیق کرده و به روش خطی بر روی پلیت حاوی محیط کشت نوترینت آگار کشت داده و به مدت 48 ساعت در دمای 30 درجه سانتیگراد گرماگذاری شد. رشد و تکثیر باکتری در محیط کشت جامد به صورت کلنیهایی ظاهر شد که شکل و رنگ و اندازه کلنیها متفاوت بود. با توجه به خصوصیات ماکروسکوپی - سطح براق یا کدر، محدب یا مسطح، ریزودرشت بودن کلنی، رنگ کلنی - جداسازی انجام شد. تمامی سویههای جداشده با استفاده از رنگآمیزی سودان سیاه برای مشخص شدن وجود دانههای پلی هیدروکسی آلکانوات موردبررسی قرار گرفتند. نحوه آمادهسازی سودان سیاه و روش رنگآمیزی نمونهها بر اساس روش Collee و همکاران صورت گرفت .[8]
-2-2 کشت میکروارگانیسم
جهت آمادهسازی مایه تلقیح هریک از دو گونه گرم منفی و خالصشده در 50 میلیلیتر محیط کشت مایع نوترینت براث به مدت 24 ساعت در شیکر انکوباتور با سرعت 200 rpm و با دمای دمای 32 درجه سانتی گراد قرار داده شدند. از سیستم ناپیوسته2 بهصورت ارلن مایر استفاده شد. 100 میلیلیتر از محیط کشت فرایندبیولوژیکی - جدول - 1 در ارلن های 250 تهیه و سپس 5 میلیلیتر %5 - حجم محیط کشت تازه - از محیط کشت تلقیح به آنها افزوده شد.
-3-2 استخراج پلی هیدروکسی آلکانوات
5 میلیلیتر از محیط کشت را به مدت 15 دقیقه با سرعت 6000 rpm سانتریفیوژ کرده سپس به بیومس 1 میلیلیتر متانول حاوی 20 درصد اسیدسولفوریک که حاوی0/65 mg/ml متیل بنزوات - بهعنوان استاندارد داخلی - و 1 میلیلیتر کلروفرم اضافه میکنیم. محلول حاصل به مدت 3/5 ساعت در دمای 100 ° C قرار گرفت. بعد از سرد شدن 0/5 میلیلیتر آب دیونیزه به آنها اضافه گردید، افزودن آب جهت جداسازی اسید و متانول اضافه از فاز آلی بوده است. بعد از جدا شدن کامل فازها، مقداری از مایع زیرین حاوی متیل استر برداشته و به ویالهای شیشهای سرپیچدار جهت تزریق به دستگاه گازکروماتوگراف منتقل شد .[9]
-4-2 روش شناسایی و تأیید بیوپلیمر طیفسنجی مادونقرمز - FT-IR -
جهت انجام آزمون ابتدا 1 میلیگرم از بیوپلیمر استخراجشده با 300 میلیگرم KBr بهصورت قرص نیمه شفاف درآورده شد. سپس طیف مادونقرمز با استفاده از دستگاه FT-IR ثبت گردید.
-3 بحث و نتیجهگیری
درنتیجه غربالگری پساب نفتی پالایشگاه نفت کرمانشاه سویه تولیدکننده PHA جداسازی شد. به علت آلودگیهای نفتی موجود در پساب نسبت کربن به نیتروژن افزایش بیش از حدی داشته است، درنتیجه زمینه رشد سویههایی که توانایی استفاده از کربن و ذخیرهسازی آن به فرم PHA رادارند، فراهم میشود. مطالعات محققان دیگر نیز نشان داد که نواحی آلوده به نفت مکانهای مناسبی برای تکثیر باکتریهای مولد PHA هستند. در بین دوگونه گرم منفی خالصسازی شده از پساب نفتی که در تست سودان سیاه دارای لکههای سیاهرنگ بودند؛ تنها یکگونه توانایی تولید بیوپلیمر را داشت. ویژگیهای ماکروسکوپی جهت شناسایی اولیه موردبررسی قرار گرفت که شکل کلنی بزرگ، گرد و با کنارهای صاف، رنگ آن زرد براق و محدب است که با انجام تعیین توالی 16srDNA باکتری از جنس Sphingobium sp تشخیص داده شد .[10] در شکل 1 کلنی های زردرنگ این باکتری قابلمشاهده است.
