بخشی از مقاله
خلاصه:
در این مطالعه تجزیه بیولوژیکی گازوئیل شناور بر روي سطح آب با کمک دو نوع باکتري گرم منفی A-1 و A-2 که از گازوئیل توزیع شده در یک جایگاه پمپ بنزین در شهر اصفهان جداسازي شده بود بررسی شد. میزان کارائی حذف گازوئیل در حالت کشت خالص و کشت مخلوط مورد ارزیابی قرار گرفت. بیشترین میزان حذف مربوط به گونه A-1 بود که قادر به حذف %88 گازوئیل شناو بر روي سطح آب بود. در ادامه میزان شاخص امولسیون سازي - E24 - میکروارگانیسم ها بررسی گردید که نشان از تولید بیوامولسیفایرها توسط باکتریها بود.
-1 مقدمه:
نشت و پخش شدن تصادفی ترکیبات نفتی دو عامل مهم ورود ترکیبات نفتی در هنگام اکتشاف، تولید، پالایش، حمل و نقل و نگهداري ترکیبات نفتی می باشند. ورود فرآورده هاي ناشی از نفت خام از طریق کشتی هایی که قادر به حمل بیش از هزاران تن فرآورده هاي نفتی می باشند یکی از عواملی آلاینده دریاها و اقیانوسها به اینگونه ترکیبات است که میزان آن نیز روز به روز افزایش می یابد
در این میان ورود برخی از ترکیبات ناشی از فرآوري نفت خام مانند گازوئیل به آبها نیز مشکلات فراوانی را براي محیط زیست ایجاد نموده است. گازوئیل در ترمینالهاي توزیع سوخت و یا در پس آب پالایشگاهها و یا در هنگام حمل نقل - دریایی و زمینی - می تواند به آبهاي پذیرنده راه یابد. گازوئیل یک ترکیب پیچیده شامل پارافین ها، الفین ها، هیدروکربن هاي آلیفاتیک و مقادیر اندکی از ملکولهاي حاوي سولفور، نیتروژن و اکسیژن می باشد.
بطور معمول ترکیبات آروماتیک سمی تر از ترکیبات آلیفاتیک با همان تعداد اتم کربن می باشند و در غلظت هاي بالاتري نیز در آب یافت می شوند که این امر به دلیل پنج برابر بالاتر بودن حلالیت آروماتیکها در مقایسه با آلیفاتیک ها می باشد
روشهاي گوناگون براي حذف این ترکیبات در محیطهاي آبی پیشنهاد شده است. روشهاي فیزیکی مانند شناور سازي و روشهاي شیمیایی مانند استفاده از سورفکتانتها بطور معمول پرهزینه و داراي محدودیتهاي فراوانی هستند. تحقیقات بسیاري بر روي تجزیه بیولوژیکی ترکیبات نفتی به انجام رسیده و نشان داده است که این روش کاملاً امکان پذیر بوده و یکی از اقتصادي ترین و موثر ترین روشهاي حذف ترکیبات نفتی از محیطهاي آبی می باشد
این مطالعه داراي دو برجستگی مهم است. یکی تجزیه گازوئیل شناور بر روي سطح آب است که محققین کمی به این موضوع پرداخته اند و دوم استفاده از میکروارگانیسم هایی که سالها در مخزن ذخیره پمپ بنزین در معرض ترکیبات نفتی بوده اند. هدف از این تحقیق مطالعه کارائی حذف گازوئیل شناور در آب با کمک میکروارگانیسم هاي جداشده از گازوئیل عرضه شده در جایگاهاي پخش سوخت می باشد. در این مطالعه مقایسه اي میان این دو گونه میکروارگانیسم جدا شده در کشت خالص و همچنین در کشت مخلوط به انجام رسیده است.
-2 مواد و روشها:
-1-2 جداسازي میکروارگانیسم:
براي جداسازي میکروارگانیسم هاي احتمالی موجود در گازوئیل عرضه شده در جایگاههاي توزیع سوخت، یک میلی لیتر از آن را در یک ارلن مایر 250 میلی لیتري حاوي 100 میلی لیتر از محیط کشت معدنی که به صورت زیر تهیه شده است می ریزیم: 0/1 گرم در لیتر MgSo4، 0/5 گرم در لیتر KH2Po4، 0/01 گرم در لیتر CaCl2.2H2o، 0/001 گرم در لیتر FeSo4، 1 گرم در لیتر NaNo3، 0/5 گرم در لیتر K2HPo4 و pH نمونه به کمک محلول هیدروکسید سدیم بر روي 7/2 تنظیم شد.
محیط فوق را در یک شیکر انکوباتور با دماي 30 درجه سانتیگراد و با شدت هوادهی 160 دور در دقیقه به مدت 72 ساعت قرار می دهیم. پس از این مدت زمان 5 میلی لیتر از محیط فوق به 100 میلی لیتر محیط کشت معدنی جدید منتقل شد و به مدت 6 روز در همان شرایط انکوباسیون گشت.
-2-2 خالص سازي میکروارگانیسم ها:
مقداري از میکروارگانیسم هاي رشد نموده در ارلن مایر حاوي محیط معدنی به یک پلیت حاوي 20 میلی لیتر محیط معدنی، جامد شده با کمک 16 گرم در لیتر آگار-آگار تلقیح شد. 100 میلی لیتر از گازوئیل را براي حذف میکروارگانیسم هاي احتمالی موجود در آن از صافی میلی پور استریل عبور داده و 1 میلی لیتر آن را به عنوان منبع کربن بر روي سطح پلیت حاوي محیط معدنی جامد پخش می نماییم. پس از گذشت 24 ساعت دونوع کلنی بر روي محیط معدنی رشد نمود. این کلنی ها را با کمک لوپ آزمایشگاهی و در شرایط استریل به محیطهاي معدنی جامد جدید انتقال داده تا در نهایت یک کشت خالص از هر میکروارگانیسم بدست آید. در نهایت از هر کلنی اسلنت تهیه کرده و در دماي 4 درجه سانتیگراد نگهداري شد.
-3-2 مطالعات میکروسکوپی:
در تمام طول مطالعه بررسی هاي میکروسکوپی با تهیه لام مرطوب انجام پذیرفت. در نهایت رنگ آمیزي گرم و مشاهده میکروارگانیسم ها با استفاده از یک میکروسکوپ با بزرگ نمایی 1000 برابر و روغن امرسیون انجام شد و عکس برداري از میکروارگانیسم ها به انجام رسید.
-4-2 سنجش کارایی میکروارگانیسم ها:
براي سنجش کارائی میکروارگانیسم ها از اسلنتهاي تهیه شده مقداري میکروارگانیسم به محیط کشت نوترینت براث انتقاد داده شد و به مدت 20 ساعت در یک شیکر انکوباتور با دماي 30 درجه سانتیگراد و شدت هوادهی 160 دور در دقیقه قرار گرفت. پس از گذشت این مدت مقداري از محیط فوق برداشت شده و میکروارگانیسم ها با کمک سانتریفوژ با سرعت 3000 دور در دقیقه به مدت زمان 15 دقیقه از محیط کشت جدا شد و نهایتاً رقیق سازي براي رسیدن میزان جذب محلول در 600 نانومتر به عدد 1 انجام پذیرفت.
از هر یک از میکروارگانیسم ها یک میلی لیتر به دو ارلن مایر 250 میلی لیتري حاوي 100 میلی لیتر محیط کشت معدنی ذکر شده در بخش 1-2 اضافه شد و براي سنجش کارائی میکرو ارگانیسم ها در حالت کشت مخلوط به یک ارلن مایر نیز 0/5 میلی لیتر از هر یک از میکروارگانیسم ها اضافه گردید. به هر ارلن مایر یک میلی لیتر گازوئیل استریل اضافه شد و در یک شیکر انکوباتور با شدت هوادهی 160 دور در دقیقه و دماي 30 درجه سانتیگراد به مدت 7 روز قرار گرفت.
-5-2 آزمون شاخص امولسیون سازي:
در این آزمون 2 میلی لیتر از هر یک از محیطهاي کشت معدنی به 4 لوله آزمایش حاوي 2 میلی لیتر گازوئیل اضافه شده و به مدت 3 دقیقه تحت ورتکس شدید قرار گرفت. سپس لوله ها به مدت 24 ساعت در یک محیط ساکن قرار گرفتند. پس از این مدت ارتفاع لایه امولسیون ایجاد شده به کل مایع موجود در لوله محاسبه شده و به عنوان شاخص امولسیون سازي گزارش گردید.
-6-2 روشهاي آنالیز:
اندازه گیري میزان گازوئیل موجود در محیط توسط سنجش میزان جذب در طول موج 400 نانومتر از نمونه استخراج شده انجام شد. منحنی کالیبراسیون رسم شده براي این منظور y = 0.1219 x - R2=0.998 - می باشد. دستگاه اسپکتروفتومتر مورد استفاده در این مطالعه JascoV-570 بود. استخراج نمونه ها از محیط کشت معدنی با استفاده از حلال تتراکلرید کربن صورت پذیرفت.
-3 بحث و نتیجه گیري:
در این مطالعه 2 نوع میکروارگانیسم به دست آمد که قادر به استفاده از گازوئیل به عنوان تنها منبع کربن خود بودند. این میکروارگانیسم ها A-1 و A-2 نامگذاري شدند. مطالعات میکروسکوپی با کمک تهبه لام مرطوب نشان از میکروارگانیسم هایی تاژك دار و با تحرك بسیار بالا در نمونه A-1 و میکروارگانیسم هایی با تحرك بسیار کم در نمونه A-2 بود. رنگ آمیزي گرم مشخص کرد که هر دو میکروارگانیسم گرم منفی و از نوع باسیل هستند.
درصد حذف گازوئیل در نمونه مخلوط %85 و در نمونه هاي A-1 و A-2 به ترتیب %88 و %84 بود. همان طور که مشخص است کارایی میکروارگانیسم ها در حذف گازوئیل شناور بر روي آب در هر دو حالت کشت مخلوط و خالص و همچنین در هر دو نوع میکروارگانیسم تقریباً یکسان بود. با توجه به تبدیل لایه گازوئیل شناور بر روي سطح آب در همان روزهاي اول به قطرات بسیار ریز احتمال تولید بیوامولسیفایرها وجود داشت که با انجام آزمون E24 تولید مقادیر اندکی از این ترکیبات تائید شد. شاخص امولسیون سازي هر دو میکرو ارگانیسم %23 و %21 محاسبه گردید. میکروارگانیسم هاي جدا شده در این مطالعه احتمالاً مربوط به مخزن ذخیره سوخت پمپ بنزین بوده است و طی سالها با مصرف ترکیبات نفتی سازگار شده است. در شکلهاي زیر تصاویري از میکروارگانیسم ها نمایش داده شده.
