بخشی از مقاله
چکیده
آلودگی های نفتی را می توان از مهمترین آلودگیهای محیط زیست به شمار آورد. زیست پالایی روشی جدید جهت رفع آلودگیهای خاک است. برخی از میکروارگانیسمها قابلیت زیست پالایی گازوئیل را به عنوان یکی از متداولترین ترکیبات نفتی دارا هستند. هدف این پژوهش جداسازی و شناسایی باکتریهای تجزیهکننده گازوئیل باقدرت بالا در شرایط آب و هوایی استان زنجان است. برای نیل به اهداف این پژوهش از خاکهای سه منطقه آلوده به گازوئیل در مناطق نفتی استان نمونهبرداری و باکتریهای توانمند با روش اسپکتوفتومتری، بیوشیمیایی و ملکولی جداسازی شدند. بررسی رشد باکتریها نشان داد که با افزایش مقدار گازوئیل تا یک درصد رشد باکتریها افزایش یافته و غلظتهای بیشتر از آن سبب کاهش رشد آنها می شود. افزایش مدت زمان انکوباسیون سبب کاهش مقدار گازوئیل از محیط کشت میشود. نتایج آزمایشهای بیوشیمیایی و بررسی توالی یابی ایزولههای باکتریها نشان داد فراوانترین گونه باکتری های شناساییشده از نوع کوکوسی ها بوده و کشت این باکتریها و افزایش آنها به محیط های آلوده به گازوئیل میتواند در پالایش این محیطها مناسب باشند.
کلید واژه: زیست پالایی، باکتری تجزیهکننده گازوئیل، اسپکتوفتومتری.
.1 مقدمه
آلودگی خاک توسط نفت و محصولات نفتی مانند بنزین، گازوئیل و ترکیبات مشابه به عنوان یکی از شایعترین و جدیترین مشکلات محیط زیست شناخته شده است 1 - ، . - 8 از پیامدهای آلودگی نفتی میتوان به حذف پوششهای گیاهی، فرسایش خاک و آلودگی های منابع آب های سطحی و زیرزمینی اشاره کرد . - 2 - تجمع این ترکیبات شیمیایی در محیط زیست، تهدیدی جدی برای سلامت انسان، موجودات زنده و اکوسیستمهای طبیعی میشود . - 1 - آلودگی محیط زیست توسط محصولات نفتی میتواند به گیاهان و جانوران یک محیط آسیب رسانده و باعث جذب و تجمع این ترکیبات در زنجیره غذایی و درنهایت به خطر انداختن محیط زندگی انسان شود.
اگرچه پیشرفت قابل توجهی در کاهش برخی از این آلودگیها در سالهای اخیر صورت گرفته، اما هنوز به طرق مختلف محیط زیست توسط این ترکیبات آلوده می شود . - 6 - زیست پالایی توسط میکروارگانیسمهای زنده بهمنظور تجزیه بیولوژیکی آلایندههای آلی و سالم سازی محیط در سالهای اخیر بهصورت گسترده استفاده می شود و یکی از تکنیک های بسیار کارآمد تصفیه خاکهای آلوده است 4 - ،2، 3، 7، . - 8تاکنون تعداد زیادی از باکتریهای تجزیهکننده مواد نفتی جداسازی و شناسایی شده است 1 - ،5، 6، . - 8 نتایج تحقیقات گذشته مؤید آن است که باکتریهای بومی شناسایی شده در کشورعمدتاً شامل Pseudomonas Stutzei، Pseudomonas aeruginosa، Acinetobacter sp.، Provedenica stuartii،Micrococcus sp.،Bacillus Cereus، Enterobacter cloacae و Serratia sp. است که از منابع خاکی و آبی آلوده به ترکیبات نفتی جداسازی شده برای تجزیه ترکیبات هیدروکربنه نفتی به کار گرفته شده است . - 5 -
یودیانی و همکاران - 2009 - در تحقیقی تحت عنوان مطالعه پتانسیل تجزیه ترکیبات نفتی توسط باکتری باسیلوس جداشده از خاکهای آلوده در هندوستان نشان دادند که باکتریها شناساییشده حداقل 27 درصد از خاکآلوده به نفت را پس از انکوباسیون در یک دوره هفت روزه مورد تخریب و تجزیه زیستی قرار داده است . - 4 - باوجود منابع مختلف ترکیبات هیدروکربنه نفتی در سطح استان زنجان تاکنون تحقیق جامعی بر روی شناسایی میکروارگانیسم های بومی تجزیهکننده این ترکیبات به انجام نرسیده است، لذا هدف از این تحقیق شناسایی و جداسازی باکتریهای بومی تجزیهکننده ترکیبات نفتی بهویژه گازوئیل در مناطق آلوده استان زنجان است.
.2 مواد و روش ها
برای نیل به اهداف این تحقیق از عمق 2 تا 10 سانتیمتری سه منطقه بهشدت آلوده نمونهبرداری انجام گرفت. از هر منطقه 10 نمونه خاک برداشت شد . نمونههای خاک در ظروف پلاستیکی درب دار استریل جمعآوری و بلافاصله به آزمایشگاه تحقیقاتی گروه زیست شناسی دانشگاه زنجان منتقل شدند. در مرحله بعد یک گرم از نمونههای خاک به همراه 1 میلیلیتر گازوئیل - بهعنوان منبع کربن - و 50 میلیلیتر سرم فیزیولوژی مخلوط شده و در شرایط دمایی 28 درجه سلسیوس به مدت 36 ساعت در 180 دور بر دقیقه انکوبه شد. از سوسپانسیون تهیهشده در محیط غنیسازی رقتهای 10-1 تا 10-5 تهیه گردید.
در این مرحله 1 میلیلیتر از نمونهها در 100 از محیط کشت مایع MSM - شامل نمک های معدنی - محتوی 0/1 در صد گازوئیل در پ-ها ش 7 کشت داده شد، محیط کشت آمادهشده در دمای 37 درجه سانتیگراد به مدت 72 ساعت در شیکرانکوباتور با 180 دور در دقیقه قرار داده شدند. پس از گذشت 72 ساعت، 1 میلیلیتر از سوسپانسیون تهیهشده در مرحله قبل برداشته و به محیط کشت جدید حاوی 0/2 درصد گازوئیل با حفظ شرایط مرحله پیشین منتقل گشت. این مرحله از کار بهمنظور افزایش تطابقپذیری1 باکتریها و همچنین ایجاد بیشترین تنش ممکن، برای انتخاب قویترین سویه تجزیهکننده تا غلظت یک درصد از گازوئیل ادامه یافت.
برای کشت میکروبی محیط کشت MSM آگار تهیه گردید و گازوئیل به میزان 1 درصد بهعنوان منبع غذایی به محیط اضافه شد. سپس بر روی محیط کشت با رقت های تهیهشده، کشت گسترده به عمل آمد. تککلنیهای رشد کرده در محیط کشت گسترده بر اساس خصوصیات مورفولوژیک، تفکیکشده و جهت ایجاد تککلنیهای خالص، بهطور جداگانه و بروش کشت خطی، بر روی محیط کشت مشابه منتقل شدند. کشت خطی بر روی دو محیط MSM جامد +گازوئیل و NAS انجام شد. تک کلنیهای خالص بهدستآمده، در محیط کشت مایع +MSMگازوئیل در شرایط دمایی 28 درجه سلسیوس و با دور 180 دور بر دقیقه به مدت 72 ساعت انکوبه شدند.
جهت سنجش میزان رشد باکتری در محیط کشت مایع % 1 +MSM گازوئیل، از روش طیفسنجی نوری استفاده گردید. تمام کلنیهای متفاوت بهدستآمده بعد از کشت در محیط مایع %1 +MSM گازوئیل هر 8 ساعت طیفسنجی شد و چهار نوع کلنی که بیشترین رشد را داشتند بهعنوان باکتریهای تجزیهکننده گازوئیل در استان زنجان انتخاب شدند و ادامه آزمایشها بر روی این چهار سویه انجام گرفت. جهت شناسایی بیشتر چهار نوع باکتری توانمند در تجزیه گازوئیل آزمون کاتالاز و آزمایش گرم انجام گرفت. استخراج ژنوم باکتریهای شناسایی شده و تکثیر توسط دستگاه PCR و مشاهده محصولهای تکثیری توسط الکتروفورز انجام شد. نتایج توالی یابی به کمک نرمافزارهای بیوانفورماتیکی Chromas، Editseq و Blast انجام گرفت و توالیهای موجود در بانک اطلاعاتی NCBI ثبت گردید . - 2 -
.3 نتیجهگیری
باکتریهای که قادر به تجزیه گازوئیل و در نتیجه تغذیه از آن بهعنوان تنها منبع کربن بودند، در محیط کشت رشد کرده و تشکیل کلنی دادند. تککلنیهای منتقل شده از کشت گسترده در محیط کشت بعدی رشد کرده و کلنیهای مشابه ای از نظر ریختشناسی تشکیل دادند. نتایج بررسی رشد باکتریهای جداشده طی 72 ساعت نشان داد که چهار باکتری جداشده بهترین رشد را در حضور گازوئیل داشتند. که با اسامی MP14، MP11، MP3 و MP1 نامگذاری شدند.MP1 بالاترین دانسیته نوری در طولموج 600 نانومتر باارزش 1/662 بعد از 72 ساعت، MP3 با دانسیته نوری باارزش 1/55، MP11 با دانسیته نوری باارزش 1/322 و درنهایت MP14 با دانسیته نوری باارزش 1/002 را به خود اختصاص دادند - شکل . - 1
با استفاده از نتایج بهدستآمده از بررسی سنتتیک رشد MP1 بهعنوان قویترین سویه جداشده شناخته شد. پس از رشد باکتریهای ایزوله موردنظر در محیط MSM، شناسایی آنها بهوسیله آزمایشهای بیوشیمیایی و طیفسنجی و استخراج DNA ژنومی و انجام واکنش PCR و توالی یابی انجام گرفت. باکتریهای بهدستآمده از نوع باکتریهای کروی شکل و از دسته کوکوسیها بودند. جدول 1 ویژگیهای بیوشیمیایی سویههای جداسازی شده را نشان می دهد. نتایج نشان داد که باکتریهای شناساییشده قادر به تجزیه گازوئیل هستند جداسازی و خالص سازی سویه MP1 بهعنوان سویه توانمند در تجزیه گازوئیل برای پاک سازی زیستی بخشی از خاکهای آلوده استان زنجان مورداستفاده قرار گیرد.
