بخشی از مقاله
چكيده
روش هاي معمول تست هاي آزمايشگاهي گاهي نشان مي دهد كه پروتئين در ادرار وجود ندارد ولي بيمار احساس درد كليه كرده يا با عفونت ادراري مواجه مي شود. در اين شرايط پزشك مجبور است براي درمان كليه را در آورده كه به دنبال آن غده ي فوق كليوي هم جدا مي شود و در نتيجه ميزان اريتروپوئيتين به عنوان مهمترين هورمون خون ساز بدن كاهش مي يابد. بنابراين، اگر پروتئين ادرار به موقع شناسايي شود پزشك مي تواند از تخريب كليه جلوگيري كرده و جلوي بسياري از هزينه هاي درمان را بگيرد. در كار حاضر، بر اساس فناوري نانو يك نانو بيوحسگر مغناطيسي طراحي كرديم كه مي تواند با تغييرات مغناطش حضور يا عدم حضور پروتئين را در نمونه هاي ادرار تشخيص دهد. اساس اين روش مبتني بر منحني هاي استاندارد است كه در نتيجه ي برهمكنش بين نانوميله هاي هماتيت با آلبومين بدست مي آيد. مشخصه هاي نانوساختاري و كارايي پزشكي نانوميله ها با استفاده از ميكروسكوپ الكتروني عبوري، مغناطيس سنج نمونه ي مرتعش، منحني استاندارد و مدل بلند-آلتمن بررسي شدند. نتايج نشان داد كه نانو بيوحسگر مغناطيسي گزينه ي مطلوبي جهت تشخيص به موقع آلبومينوري بوده و مي تواند از تخريب كليه و هزينه هاي درماني ممانعت كند.
مقدمه
در سال هاي اخير، مشكلاتي كه برخي از روش هاي تشخيص بيماري از قبيل نمونه برداري از بافت [1]، تشخيص از راه خون [2]و تصوير برداري پزشكي [3] دارند اين است كه در مرحله ي نخست تشخيص چندان مطلوب نبوده و علاوه بر گران بودن براي بسياري از افراد دسترس پذير نيستند. در اين ميان نشانگرهاي زيستي مثل DNA/RNA، پروتئين ها و مواد شيميايي آلي مي توانند در يك نانو بيوحسگر به عنوان يك شاخصي از حالت يا وضعيت بيولوژيكي مطرح شوند. هدف اين است كه نانو بيوحسگر مغناطيسي بتواند با حساسيت بالاتري نسبت به روش هاي متداول غلظت پروتئين آلبومين را در ادرار اندازه گيري كند به همين جهت از برهمكنش نانوميله ها با آلبومين استفاده كرديم.
زيرا، هنگامي كه نانوميله ها با پروتئين موجود در نمونه هاي بيولوژيكي برهمكنش مي كنند، به دليل حضور CTAB به عنوان ماده ي فعال سطحي در سطح نانوميله ها، مغناطش آن ها كاهش مي يابد در نتيجه نانو بيوحسگر قادر خواهد بود حداقل پروتئين موجود در ادرار را شناسايي كند. نتايج نشان داد كه نانو بيوحسگر مغناطيسي با قابليت تشخيص دقيق، سريع و كاراتر نسبت به روش آزمايشگاهي مي تواند از بسياري از هزينه هاي درماني جلوگيري كرده و در نتيجه نخستين علائم بيماري را زودتر از ساير روش ها تشخيص دهد.
روش آزمايش
براي ساخت نانوميله هاي مغناطيسي هماتيت نخست محلول ٢٥/٠ مولار FeCl3 را تهيه كرده سپس ٥/٨ ميلي ليتر از محلول ٢ مولار NaOH را به طور قطره قطره به آن مي افزاييم. سپس ٨ ميلي ليتر از آب مقطر را در دماي اتاق به محلول بالا و در ظرفي كه تحت چرخش است اضافه مي كنيم. CTAB را به عنوان عامل فعال سطحي جهت رشد نانوميله ها در ظرفي جداگانه و با غلظت هاي متفاوت آماده سازي مي كنيم. در مرحله ي دوم دو ظرف آماده سازي شده از پيش ماده هاي مغناطيسي هماتيت و CTAB را با يكديگر تركيب كرده و در ظرفي تحت چرخش مغناطيسي قرار مي دهيم. محصول بدست آمده را به دستگاه اتوكلاو با ظرفيت ٦٠ ميلي ليتر منتقل كرده و در دماي ١٥٠ درجه سانتي گراد به مدت ٦ ساعت قرار مي دهيم. در نهايت نمونه را از دستگاه خارج كرده و اجازه مي دهيم تا دماي اتاق سرد شود. محصول نهايي با شست و شوي محلول به اندازه ي ٣ مرتبه با آب مقطر بدست مي آيد و براي آناليزهاي مد نظر آماده خواهد بود.
تكنيك هاي تجربي
مورفولوژي نمونه هاي سنتز شده در حالت هاي قبل و بعد از برهمكنش با پروتئين با تكنيك ميكروسكوپ الكتروني عبوري - TEM - بررسي شدند. تكنيك مغناطيس سنج نمونه ي مرتعش - VSM - را براي مطالعه ي رفتار مغناطيسي محصولات بدست آمده و منحني استاندارد استفاده كرديم. در نهايت براي مقايسه ي كارايي پزشكي روش نانو بيوحسگر مغناطيسي در مقايسه با روش آزمايشگاهي مدل بلند-آلتمن را روي تعدادي از نمونه هاي بيولوژيكي با غلظت هاي نامشخص از پروتئين به كار برديم. شكل ١ تصوير TEM از نانوميله ها را نشان مي دهد كه در غلظت هاي 0/025، 0/05 و 0/1 مولار از CTAB ساخته شدند.
همانطور كه مشاهده مي كنيد در نسبت مولي 1:3/4 از FeCl3:NaOH به ازاي نسبت هاي مولي متفاوت از ماده ي فعال سطحي شاهد تشكيل نانوساختارهاي ميله اي شكل يكنواختي هستيم به طوري كه با افزايش غلظت مولي CTAB طول متوسط نانوميله هاي هماتيت از ٣٢ به 25 كاهش مي يابد.شكل١ : تصاوير TEM از نانوميله هاي مغناطيسي هماتيت تهيه شده در غلظت هاي - الف - 0/025 مولار، - ب - 0/05مولار و - ج - 0/1مولار از CTAB كه طول متوسط آن ها با نرم افزار digimizer به ترتيب برابر 32، ٢٦ و٢٥ بدست آمده است.براي بررسي مغناطش نانوميله ها و همچنين تعيين محدوده اي از غلظت هاي آلبومين جهت سنجش كمي پروتئين در ادرار، از تكنيك VSM استفاده نموديم. مطابق شكل ٢ با افزايش غلظت CTAB در نتيجه ي شكل گيري لايه هاي بيشتري از ماده ي فعال سطحي بر سطح نانوميله ها شاهد كاهش مغناطش آن ها هستيم.
شكل ٣ طيف VSM نانوميله هاي مغناطيسي هماتيت را در برهمكنش با پروتئين نشان مي دهد. همانطور كه ملاحظه مي كنيد، با توجه به محدوده ي استاندارد ٤/٠ تا ٤/٦ ميلي گرم بر ميلي ليتر از آلبومين، تغيير قابل ملاحظه اي در مقادير عددي مغناطش براي نمونه ي بدون آلبومين و نمونه هايي با غلظت ٤/٠ و ٨/٠ ميلي گيرم بر ميلي ليتر ملاحظه نمي شود. اما در غلظت هاي ٦/١، ٢/٣ و ٤/٦ ميلي گرم بر ميلي ليتر از آلبومين شاهد تفاوت محسوسي در مغناطش هستيم. بنابراين مي توان گفت كه حساسيت روش فوق به اندازه اي است كه اين مقادير را از يكديگر تمايز دهد. شكل ٤ تصاوير TEM از برهمكنش بين نانوميله ها و پروتئين است كه نشان مي دهد.
اين برهمكنش الكترواستاتيكي تا حد مشخصي براي نانوميله ها قابل تحمل خواهد بود. نانوميله ها با CTAB كه بار سطحي مثبت دارد احاطه شده اند و ساختار پروتئين در حالت ميانگين شامل بار سطحي منفي است [4]، پس تنها تعامل موجود بين نانوميله ها و پروتئين بصورت نيروهاي الكترواستاتيك است. در برهمكنش نانوميله ها با پروتئين، از آنجا كه نانوميله ها با CTAB به عنوان ماده ي فعال سطحي ساخته شدند، وقتي كه غلظت پروتئين بيشتراز CTAB شود تجمع خودبخود اتفاق افتاده و مايسل ها تشكيل مي شوند. در اين تجمع قسمت آب گريز درمركز مايسل بوده و گروه هاي قطبي با سطح آب برهمكنش مي دهند.
اندازه و شكل مايسل به ساختار مولكول هاي فعال كننده سطحي و آرايش فضايي آن ها در برهمكنش بستگي دارد كه به شكل كروي در سرتاسر حلال پراكنده مي شوند. انتظار مي رود كه مورفولوژي نانوميله ها بعد از برهمكنش به صورت كروي تغيير كند.[5] از طرفي با افزايش غلظت پروتئين در حضور لايه هاي عوامل سطحي ، مقدار ذرات مغناطيسي معلق در حلال و همچنين ميزان نفوذ مغناطيسي كمتر شده و مغناطش نانوميله ها نيز بعد از برهمكنش كاهش مي يابد - شكل ٥ - .[6] از كاهش مغناطش در برهمكنش پروتئين وCTAB مي توان به وجود آلبومين در نمونه ي بيولوژيكي پي برد كه مقدار آن با كمي سازي داده ها در منحني مغناطش بر حسب غلظت بدست مي آيد.
هدف ما رسم منحني استاندارد است كه نموداري است با شيب افزاينده به طوري كه مغناطش هر نقطه را به غلظت پروتئين در همان ناحيه مرتبط مي سازد. شكل ٦ منحني استاندارد نانوميله هاي مغناطيسي هماتيت را در برهمكنش با آلبومين نشان مي دهد. همانطور كه مي بينيد ارتباطي بين كاهش مغناطش و غلظت آلبومين از ٤/٠ تا ٤/٦ ميلي گرم بر ميلي ليتر وجود دارد. بدين منظور كافيست نسبت مقدار M0 كه مغناطش بدون برهمكنش به Mn به عنوان مغناطش برهمكنشي مي باشد را بدست آورد. مقدار عددي غلظت با قرار دادن اين نسبت در معادله ي استاندارد Y=1/0229+0/144X بدست مي آيد. مقدار R2 كه برابر با ٩٧ درصد بدست آمد نشان از اطمينان پذير بودن جواب ها دارد. در نتيجه
