بخشی از مقاله
چکیده
استفاده از نانوحامل آلبومین سرم انسانی - Human serum albumin - به دلیل زیست سازگاری، زیست تخریب پذیری، عدم سمیت و ایمنی-زایی، در دسترس بودن، قیمت ارزان و داشتن گروههای عاملی متعدد توانایی ظرفیت اتصال به مقادیر قابل توجه دارو را دارد .این نانوذرات به روش ضد انحلال سنتزشد و ایمیپنم درنانوذرات آلبومین سرم انسانی بارگذاری شد. نانوذرات آلبومین سرم انسانی به تغییرات pH، میزان گلوترآلدئید، سرعت افزودن اتانول و غلظت اولیه محلول پروتئینی حساس بود.
اندازه نانو ذرات بارگذاری شده با آلبومین سرم انسانی 81 نانومتر با بازدهی کپسولی%20 و درصد انکپسوله شدن 42.8.% بود. آزمایشهای ضد میکروبی نشان داد که نانوذرات حامل ایمیپنم تاثیر معنا داری بر روی چهار باکتری پاتوژن شامل: اشرشیاکلی - Escherichia coli - ، سودوموناس آئروژینوزا - - Pseudomonas aeruginosa، باسیلوس سرئوس - Bacillus cereus - ، کلبسیلا پنومونیه - Klebsiella pneumoniae - داشت. و تاثیر قابل توجهی نسبت به فرم آزاد آنتیبیوتیک داشت.
.1 مقدمه و هدف
استفاده از نانوتکنولوژی در ایمن سازی، طراحی، رهایش داروهای ضد میکروبی، تشخیص و کنترل عفونت های مجدد به ویژه در غلبه بر پاتوژنهای مقاوم به آنتی بیوتیکها به عنوان جایگزین مناسب آنتی بیوتیکها مورد بررسی قرارگرفته است. نانوذرات ضد میکروبی ممکن است اثرات نامطلوب مستقیم وحاد نداشته باشند و می توانند در مقایسه با سنتز آنتی بیوتیکها مقرون به صرفه، پایدار و با نیمه عمرطولانی باشند.
رهایش آنتی بیوتیک ها توسط نانوذرات امکان مقابله با باکتریهایی که بیوفیلم تشکیل میدهند و همچنین باکتریهای مهاجم درون سلولی را فراهم میکند. نانوحاملها ازآنتی بیوتیکها در مقابل آنزیمها محافظت نموده و باعث افزایش نفوذ آنها به باکتری می شوند. اندازه کوچک نانوذرات سبب تسهیل ورود آنها به سلول میزبان از طریق اندوسیتوز/ فاگوسیتوز میشود و در نتیجه سبب رهایش آنتی بیوتیکها و افزایش غلظت آنها در محل عفونت میشود.
استفاده از پلیمرها برای ساخت نانوذرات پلیمری، به دلیل قابل تغییربودن ویژگیهای فیزیکوشیمیایی شان - اندازه ، بار سطحی و آبگریزی - رهایش دارویی، امکان بارگذاری مقادیر بالای مواد دارویی، جلوگیری از تخریب دارو انعطاف پذیری قابل توجهی را در طراحی فراهم میسازد .[1] استفاده از نانوحامل بیوپلیمری آلبومین سرم انسانی به دلیل زیست سازگاری، زیست تخریب پذیری، عدم سمیت، قیمت ارزان و در دسترس بودن جهت رهایش دارو و کپسوله کردن آنتی بیوتیکها مورد استفاده قرار گرفته است 1]و [.2
.2 تئوری و پیشینه تحقیق
بین سالهای 1900 تا 1996 مرگ ومیر ناشی از عفونتهای میکروبی درایالات متحده آمریکا به صورت قابل توجهی از 797 مرگ در صد هزار نفر به 59 مرگ در صدهزارنفر کاهش پیدا کرد در حدود 3 سال بعد باکتریها خود را به سیستمهای دفاعی مختلفی در برابر آنتیبیوتیکها مجهز کردند و در برابرآنها مقاوم شدند به گونه ایی که اولین مقاومت آنتی بیوتیکی در سال 1947 گزارش شد3] و .[4 براساس گزارش سازمان بهداشت جهانی در سال 2014 مقاومت آنتیبیوتیکی به تنهایی 21 تا 34 میلیون دلار به سیستم سلامت آمریکا هزینه تحمیل کرده است.
ادامه تکامل باکتریها و مقاومت نسبت به آنها باعث ناکارآمد شدن بسیاری از آنتی بیوتیکهای معمول شده است. اخیرا بیش از 20/000 ژن مقاومت - r gene - در 900 تایپ در توالی ژنومی عمده باکتریها گزارش شده است .[5] یکی ازآنتی بیوتیکهای بسیار قوی که تاثیرگذاری آن به شدت کاهش یافته کارباپنم است که در درمان بیماری های ناشی از باکتری کلبسیلا پنومونیه استفاده میشود. برخی نسبت به تبدیل شدن قرن بیست و یکم به قرن پس از آنتی بیوتیک هشدار دادهاند. علاوه براین، برخی از باکتریها توانایی مقاومت به عوامل ضد میکروبی متعدد دارند این پدیده به عنوان مقاومت به چندین دارو شناخته شده است.
ایمیپنم: داروهای کارباپنم - شامل ارتاپنم، ایمیپنم، دوریپنم، مروپنم و بیاپنم - در درمان بیماریهای ناشی از از باکتریهای مقاوم به بتالاکتام بسیار موثر بودهاند. دلیل طیف وسیع فعالیت آنها پایداری در مقابل هیدرولیز توسط اغلب بتالاکتامازها1است.کارباپنمها را ازطریق صناعی از تینامایسین2 بدست میآورند. تینامایسین ازباکتری استرپتومایسس کالتیه - - Streptomyces calvetia حاصل میشود.
کارباپنمها از طریق اتصال به PBP غشای باکتریها نهایتا سبب مرگ ارگانیسمهای حساس به این آنتی بیوتیکها میشود و در درمان عفونتهای ناشی از باسیلهای گرم منفی مقاوم به پنی سیلین یا سفالوسپورین استفاده می شود6] و .[7 ایمیپنم با پیوند کووالانسی به PBP2s - PBP - ، بیوسنتزموکوپپتیدها را در دیواره سلولی باکتری مختل میکند و سبب مهار رشد و تقسیم سلولی باکتری و ازدست رفتن تمامیت دیواره سلولی میشود و باعث افزایش نفوذپذیری غشای خارجی سلولها و اثر روی سیستم پمپ آنها میشوند.[7]
آلبومین سرم انسانی: فراوان ترین پروتئین موجود در پلاسمای خون انسان است و توسط کبد سنتز میشود. این پروتئین حدود %60 از کل پروتئینهای پلاسما را به خود اختصاص داده و نیمه عمرآن حدود 19 روز است .[8] آلبومین درون سلول درتنظیم فشاراسمزی نقش مهمی در اتصال وانتقال مواد غذایی به سلولها دارد. آلبومین از معدود پروتئینهایی است که فاقد کربوهیدرات بوده، از یک رشته پلی پپتیدی با 585 آمینواسید تشکیل شده که وزن مولکولی آن 66/438 Da ، حاوی 35 ریشه سیستئین که با تشکیل 17 پیوند دی سولفیدی نقش بنیادی در ساختار این پروتئین دارد. وجود تعداد زیاد اسید آمینه موجب ایفای نقشهای بیولوژیک متعدد شده است. بسیاری از داروهای درون سلولی متصل به آلبومین، به عنوان مخزن وانتقال دهنده پروتئین استفاده میشود.
به طور کلی پلیمرهای مورد استفاده در تهیه این ساختارها به دو دسته پلیمرهای طبیعی مانند کیتوزان3، آلبومین4 ،هپارین5 و پلیمرهای سنتزی مانند 2 - - N هیدروکسی پیریل6، مت آکریل آمید کوپلیمر7، پلی لاکتیک اسید8، پلی L گلوتامیک اسید9 و پلی لاکتیک کوگلایکولید اسید10 تقسیم میشوند. نانوذرات پلیمری به عنوان حاملهای دارویی از پلیمرهای زیست تخریب پذیر و انواع غیرزیست تخریب پذیر ساخته میشوند.
در سالهای اخیر نوع زیست تخریب پذیر آنها به سبب توانایی در رهایش دارو، امکان بارگذاری مقادیر بالای مواد دارویی و جلوگیری از تخریب دارو توجه قابل ملاحظه ای را به عنوان سیستمهای بالقوه مناسب برای دارورسانی به خود اختصاص دادهاند. در این سیستم، دارو هم به صورت به دام افتاده و یا اتصال یافته توسط پیوند کووالانسی به ماتریس پلیمری بارگذاری میشوند. علاوه بر این نانوذرات پلیمری به منظور بهبود کیفیت سطح که میتواند باعث افزایش کارایی جذب دارویی شود نیز به کار برده میشوند .[9]
.3 مواد و روشها
روش تهیه استاندارد نیم مک فارلند
جهت استاندارد کردن غلظت تلقیح برای آزمایش تعیین حساسیت میکروبی، باید از استاندارد سولفات باریم - BaSo4 - ، برابر با استاندارد نیم مک فارلند استفاده شود. ازکلرور باریم دهیدراته، اسیدسولفوریک، مزور، بالن ژوژه، لوله آزمایش در پیچ دار استریل استفاده شد. استاندارد نیم مک فارلند سولفات باریم به روش زیر تهیه شد: 0/5 میلیلیتراز کلرورباریم - - BaCl2 0/048 مول/لیتر - - %1/175W/VBaCl2. 2H2O را به 99.5 میلیلیتر اسید سولفوریک0/18مول/ لیتر - حجمی/حجمی - %1 اضافه شد و با همزدن مداوم سوسپانسیونی بدست آمد. چگالی صحیح کدورت استاندارد با استفاده از اندازهگیری جذب در اسپکترو فتومتر با طول مسیر نوری 1 سانتیمترمشخص شد. جذب درطول موج 625 نانومتر 0/09 بود.
ازاین سوسپانسیون تهیه شده 5 میلیلیتر در لولههای درپیچدار ریخته شد. تعیین حساسیت دارویی به روش انتشاردیسک: ایمیپنم با غلظت1.4 میلیگرم در1میلیلیترآب مقطرحل شد. و توسط پنس ظریفی که قبلاً در الکل گرفته و بعد با شعله استریل و سردشده، برداشته و درمحلول حاوی آنتیبیوتیک به مدت 5 دقیقه قرارداده شد. سپس به کمک پنس، دیسک ها درمحیط کشت نوترینت آگار حاوی باکتریهایی که با سوآپ کتانی استریل کشت چمنی گسترده داده شدند قرارداده شد دیسکها را باید مختصری فشار دادتا کاملاً با سطح محیط کشت تماس یابند.
سپس پلیتها به مدت 24 ساعت در دمای 37 درجه در انکوباتور قرارگرفت. بعد از 24 ساعت پلیتها در زیر چراغ بررسی شد و قطر هاله عدم رشد با خطکش اندازه گیری شد. نتایج با جدول حساسیت آنتیبیوتیکی مقایسه شد. سنتز نانو ذرات آلبومین سرم انسانی: از بین روشهای مختلف سنتز نانوذرات آلبومین سرم انسانی از روش ضدانحلال استفاده شد. 50 میکرولیتر از محلول آلبومین سرم انسانی در 950 میکرولیتر آب مقطر با 6.30 pH حل شد و به فالکون استریل با مگنت درون آن روی همزن مغناطیسی با دور 500 افزوده شد.
این مرحله 5 دقیقه به طول انجامید تا آلبومین به خوبی در آب مقطر حل شود. مقدار 1.4 میلیگرم ایمیپنم به محلول افزوده شد سپس 4 میلیلیتر اتانول به عنوان عامل ضد انحلال به محلول اضافه شد. سرعت افزودن اتانول عامل مهمی در تشکیل نانوذرات پایداراست به این منظور باید اتانول حتما قطره قطره به محلول نانوذرات افزوده گردد به همین علت از سرنگ استریل استفاده شد سرعت افزودن اتانول 1.5 میلی لیتر بر دقیقه بود. از گلوترآلدئید استوک %8 تهیه شد و 12 میکرولیتر از آن به محلول در حال استرایر افزوده شد علت استفاده از گلوترآلدئید بهعنوان عامل اتصال دهنده عرضی در نانوذرات بود.
نانو ذرات سانتریفیوژ شد به منظور سنجش اندازه و ویژگی-های مورفولوژیکی نانوذرات به ترتیب ازدستگاههای تفرق دینامیکی نور - DLS - و میکروسکوپ الکترونی نگاره استفاده شد. نانو ذرات دارای قطر 80 نانومتر و شکل کروی داشت. بررسی اثر ضد باکتریایی ایمیپنم کپسوله شده در نانوذرات آلبومین سرم انسانی: روش انتشار حفره در آگار در این روش همانند روش انتشار دیسک سوسپانسیون میکروبی در سطح پلیت آگارپخش شد سپس یک سوراخ با قطر 6 تا 8 میلیمتر در شرایط استریل با پانچ استریل از آگار برداشته شد سه آنتیبیوتیک کپسوله شده در نانوذرات سانتریفیوژ شد سپس رسوب آنتیبیوتیک کپسوله شده در نانوذرات در 1 میلیلیترآب مقطراستریل حل شد برای حل شدن بهتر از ورتکس استفاده شد. و مقدار200 میکرولیتر از نانوذره حاوی آنتیبیوتیک به حفرهها اضافه شد و به مدت 24 ساعت در دمای 37 درجه انکوبه شد.
