بخشی از مقاله
چکیده
امروزه آنزیمهای میکروبی کاربردهای فراوانی در صنایع مختلف دارند. متوسط رشد سالانه بازار جهانی آنزیمهای صنعتی 33/3 درصد افزایش داشته است. پروتئازها بر اساس جایگاه کاتالیتیکی به دو دسته پروتئازهای خارج سلولی و پروتئازهای داخل سلولی تقسیم میشوند. حداکثر فعالیت پروتئازهای اسیدی در اسیدیته، 2 تا 6 پروتئازهای خنثی در 5/6 تا 5/7 و پروتئازهای قلیایی در 8 تا 11 است. پروتئازها شامل گروه خیلی بزرگ از آنزیمها میباشند آنزیم پروتئاز قلیایی که کاربردهای فراوانی در صنعتاند، مهمترین باکتریهای مولد آنزیم، پروتئاز قلیایی باسیلوس لیکنی فورمیس، باسیلوس آلکالوفیلوس و باسیلوس سابتیلیس هستند.
پروتئازها نقش کلیدی در بسیاری از فرایندهای فیزیولوژیکی بدن بازی میکنند. پروتئینها دارای یک ساختار پیچیده هستند که برای تبدیل شدن به مولکولهای ریزتر به این آنزیم نیاز دارد. بدون پروتئازها، مخاط روده قادر به هضم پروتئینها نیستند.
نتایج حاصل از مطالعات و بررسی های صورت گرفته نشان میدهد، بیشتر آزمایشها و پژوهشهایی که در زمینه تولید آنزیم پروتئاز قلیایی انجام گرفته با استفاده از سویه های میکروبی استاندارد و آماده بوده است. آنزیم پروتئاز جداسازی شده از این سویه، ویژگیهای قابل توجهی از جمله فعالیت و پایداری درpHهای قلیایی، فعالیت در حضور غلظتهای نمکی مختل، فعالیت و پایداری قابل توجه در حضور حلالهای آلی را دارا بود.
مقدمه
آنزیمها گروهی از پروتئینها هستند که توسط موجودات زنده تولید میشوند. آنها بدون آن که مصرف شوند انجام یک واکنش شیمیایی را میسر ساخته و سرعت آن را افزاش میدهند. به آنها بیوکاتالیز نیز میگویند. فعالیت آنزیمها اختصاصی است و هر آنزیم واکنش خاصی را کاتالیز مینماید
در سوخت و ساز مواد خوراکی هنگام هضم و متابولیسم حضور آن ها ضروری است، تا به امروز بیش از 3000 نوع آنزیم مختلف مورد بررسی قرار گرفته اند که آنها از منابع میکروبی، گیاهی و غیره تولید میشدند [2]، در کاربردهای مختلف مانند لبنیاتی، گوشتی و غیر استفاده میشوند. در این بین، پروتئازها یکی از پر مصرف ترین آنزیمهای مورد استفاده در صنعت هستند پروتئاز که به نام آنزیم پروتئولیتیک، پپتیداز و یا پروتئیناز نیز شناخته میشود، یک نوع آنزیم است که به طور عمده برای هضم انواع مختلف پروتئین کاربرد دارد.
امروزه آنزیمهای میکروبی کاربردهای فراوانی در صنایع مختلف دارند. متوسط رشد سالانه بازار جهانی آنزیمهای صنعتی 33/3درصد افزایش داشته است. منابع میکروبی یک قلمرو بزرگ در تولید انواع پروتئاز اسیدی، خنثی و قلیایی را شامل شده است. پروتئازهای قلیایی به دلیل مقاوم بودن، پایداری و فعالیت در شرایط سخت مانند pH قلیایی و حضور عوامل سورفاکتانت یا اکسید کنندهها بسیار مهم میباشند 3]،.[4 هدف اصلی در این مطالعه بررسی نتایج و گزارشهای ارایه شده جداسازی، شناسایی و معرفی سویههای مخمری بومی برتر مولد آنزیم پروتئاز قلیایی و استخراج این آنزیم توسط میکروارگانیسمها است.
آنزیم پروتئاز
بعد از آمیلازها، پروتئازها مهم ترین آنزیمهای صنعتی محسوب میشوند، پروتئازها دارای کاربردهای زیادی در صنایع گوناگون همچون صنایع غذایی، شویندهها، داروسازی وغیره میباشند. سالانه حدود 500 تن از این آنزیمها بر مبنای پروتئین خالص تولید میشود . تولید و استفاده از آنزیم های صنعتی در طول چند دهه گذشته افزایش چشم گیری داشته است. آنزیم پروتئاز سبب کمک به هضم مواد پروتئینی می شود و حیوانات ضعیف یا جوان را که ممکن است در هضم مواد پروتئینی مشکل داشته باشند، یاری میکند.
فعالیت پروتئولایتیک همچنین میتواند جذب بیشتری از اسیدهای آمینه مواد خوراکی را به وسیله تجزیه ساختمان پروتئین با منشاء گیاهی، ممکن کند. مهم ترین وجه تمایز آنزیم پروتئاز pH اپتیمم آن است ، از این نظر پروتئازهای تجاری به سه گروه اسیدی، خنثی و قلیایی تقسیم میشوند. حداکثر فعالیت پروتئازهای قلیایی در pH 9 الی 11 بوده و محدوده وسیعی از پیوندهای محدوده پپتیدی را میشکنند. این آنزیمها دارای کاربردهای زیادی هستند و در صنایعی مانند صنایع شوینده و پاک کنندهها، چرمسازی و دباغی و صنایع غذایی، صنایع تخمیری، انتقال زیستی، تصفیه پسابهای پروتئینی، تولید موادمعطر و خوشطعم، صنایع روغنکشی، صنایع الکل سازی و غیره استفاده میشوند
پروتئازها از طریق اضافه کردن ملکول آب به پیوندهای پپتیدی موجود در پروتئین باعث هیدرولیز آن میشوند که به آن پروتئولیز میگویند. محصول پروتئولیز نیز قطعات پروتئینی و پپتیدی و اسیدهای آمینه آزاد هستند. پروتئازها بر اساس جایگاه کاتالیتیکی به دو دسته پروتئازهای خارج سلولی و پروتئازهای داخل سلولی تقسیم میشوند. حداکثر فعالیت پروتئازهای اسیدی در اسیدیته، 2 تا 6 پروتئازهای خنثی در اسیدیته، 5/6 تا 5/7 پروتئازهای قلیایی در اسیدیته 8 تا 11 است.
پروتئازها شامل گروه خیلی بزرگ از آنزیمها میباشند آنها در خواصی مانند ویژگیهای سوبسترا، جایگاه فعال و عمل کاتالیزوری pH و دمای بهینه و پایداری متفاوت هستند پروتئازها بر اساس مکانیسم پروتئولیتیک و گروه عاملی در جایگاه فعال، به چهار گروه، سرین پروتئاز، آسپارتیک پروتئاز، سیستئین پروتئاز و متالوپروتئاز تقسیم میشوند
بر طبق کمیته نام گذاری اتحادیه بین المللی بیوشیمی و بیولوژی ملکولی، پروتئازها در زیرگروه چهار از گروه سه - هیدرولازها - قرار میگیرند. پروتئازها بر اساس سه ویژگی اصلی میتوانند طبقه بندی شوند:
-1واکنش کاتالیز شده
-2طبیعت شیمیایی کاتالیتیک سایت
3 -روابط تکاملی به طور فراتر پروتئازها بر اساس مکانیسم کاتالیتیک شان به گروه های
سرین پروتئازها، آسپارتیک پروتئازها، سیستئین پروتئازها و متالو پروتئازها تقسیم بندی می شوند .[7] همچنین آن ها بر اساس توالی آمینواسیدهایشان و روابط تکاملی به دو خانواده مختلف تقسیم می شوند. علاوه بر این همان طور که در اپتیمم فعالیت نیز می توان پروتئازها را به سه گروه اسیدی، خنثی و قلیایی pH قبل ذکر گردید بر اساس تقسیم نمود
منابع تولید آنزیم پروتئاز
از آنجایی که پروتئازها از لحاظ فیزیولوژیکی برای موجودات زنده ضروری هستند بنابراین در تنوع گسترده ای از منابع مانند گیاهان، حیوانات و میکروارگانیسم ها تولید می شوند
پروتئازهای تجاری به وسیله سه روش زیر تولید می شوند: -1بافت های حیوانی -2سلول های گیاه -3سلول های میکروبی
پروتئازهای میکروبی
ناتوانی پروتئازهای گیاهی و حیوانی برای تامین نیازهای اخیر جهانی منجر به افزایش علاقه و توجه به پروتئازهای میکروبی شده است. پروتئازهای باکتریایی، قارچی و ویروسی به دلیل اهمیت وکاربردشان در صنایع و بیوتکنولوژی به طور گستردهای مورد مطالعه قرار گرفتهاند. سرین پروتئازهای قلیایی به طور اختصاصی به فرمول شویندهها اضافه میشوند. از لحاظ تجاری سرین پروتئازهای قلیایی بیشترین کاربرد را دارند.
مهمترین سرین پروتئازهایی که هم اکنون استفاده میشوند سابتیلیزین کارلزبرگ جدا شده از باسیلوس لیکنی فورمیس، سابتیلیزین بیپی ان از باسیلوس آمیلو لیکنی فورمیس، سابتیلیزینای و سابتیلیزینانایتی از باسیلوس سابتیلیس هستند. کاربرد تجاری پروتئازهای میکروبی به علت تولید نسبتا آسان در مقیاس بزرگ در مقایسه با پروتئازهای گیاهی و حیوانی جذاب است. پروتئازهای میکروبی از خاک، فضولات دامی، دریا و غیره گرفته و به روشهای مختلف مانند غوطهوری و غیره کشت و با روشهای مثل سانتریفیوژ سوسپانسیون باکتری از محیط کشت جدا سازی و استخراج [12] و به ماده مورد نظر افزوده میشوند
پروتئازهای با منشا میکروبی نسبت به پروتئازهای گیاهی و حیوانی ارجحیت دارند زیرا آنها تقریبا همه ویژگی های مورد نظر برای کاربردهای صنعتی را دارا میباشند. میکروارگانیسمها یک منبع جذاب برای تولید پروتئازها هستند زیرا میتوان آنها را در مقادیر زیاد و با استفاده از روشهای تخمیر کشت داد و در مدت زمان نسبتا کوتاهی به مقادیر بالایی از محصول مورد نظر دست یافت. همچنین آنها میتوانند به منظور دستیابی به آنزیمهای جدید با خواص تغییر یافته که برای کاربردهای مورد نظر مناسب اند مورد دست ورزی ژنتیکی قرار گیرند
به طور کلی پروتئازهای میکروبی در طبیعت خارج سلولی هستند و به طور مستقیم به محیط کشت تخمیر ترشح میشوند که این باعث ساده شدن فرآیندهای پایین دستی آنزیم در مقایسه با پروتئازهای گیاهی و جانوری میگردد. پروتئازهای میکروبی خصوصا آنهایی که توسط سویههای باسیلوس تولید میشوند به طور سنتی سهم برجسته خود را در بازار جهانی فروش آنزیمهای صنعتی با کاربرد اصلی در ترکیب شویندهها حفظ کردهاند
پروتئازهای قلیایی
پروتئازهای قلیایی به آن دسته از پروتئازها اطلاق میگردد که در یک دامنه PH خنثی تا قلیایی فعالیت دارند. آنها یا سرین پروتئاز و یا متالو پروتئاز هستند. پروتئازهای قلیایی مهمترین گروه آنزیمهایی هستند که به طور تجاری به کار گرفته شدهاند. این پروتئازها در PH حدود 10 بالاترین فعالیت را دارند. همه آنها پیوندهای پپتیدی که در سمت کربوکسیل آن ها ریشههای آمینو اسیدی آروماتیک یا هیدروفوب موجود باشد را به طور اختصاصی هیدرولیز میکنند. همچنین این آنزیمها به دلایل زیادی نسبت به کاتالیستهای شیمیایی معمول مفیدتر میباشند. برای مثال فعالیت کاتالیتیک بالایی از خود نشان میدهند، ویژگی بالایی برای سوبسترا دارند، که توجیه اقتصادی دارند.
خصوصا پروتئازهای قلیایی میکروبی که بازار جهانی آنزیمها را تحت سلطه خود گرفتهاند به علت تنوع بیوشیمیایی و کاربردهای گسترده در صنایع دباغی، غذایی، پزشکی، شوینده و فرایندهایی از قبیل تیمار فاضلاب، بازیافت نقره، تولید پروتئین هیدرولیز شده و غیره دارای پتانسیل صنعتی قابل توجهی هستند. پروتئازهای قلیایی باکتریها به وسیله فعالیت بالای آنها در PH قلیایی و ویژگی سوبسترایی گسترده آن ها مشخص میشوند. از میان همه باکتریهای قلیا دوستی که برای استفاده در صنایع مختلف جداسازی شده اند، مشخص شده است که اعضای جنس باسیلوس به خصوص سویههای باسیلوس سوبتیلیس و باسیلوس لیکنی فرمیس منابع غالب و سودآور پروتئازهای قلیایی هستند
آنزیم پروتئاز قلیایی کاربردهای فراوانی در صنعت دارد که شامل صنایع غذایی، صنایع تخمیری، شویندهها و دترجنتها، چرمسازی و دباغی، مکمل غذایی دام طیور، صنعت روغن کشی، صنعت الکلسازی، صنایع نساجی، داروسازی و غیره است مهمترین میکروارگانیسمهای مولد آنزیم پروتئاز قلیایی، مخمر ها، قارچ ها و باکتریها هستند. منابع اصلی تولید پروتئازها از حیوانات، گیاهان و باکتریها قارها و غیره میباشند. اما تولید آنزیمها از منابع گیاهی و حیوانی به دلیل شرایط آب و هوایی و موضوعات وابسته به آن محدود است. مهمترین باکتری های مولد آنزیم، پروتئاز قلیایی باسیلوس لیکنی فورمیس، باسیلوس آلکالوفیلوس و باسیلوس سابتیلیس هستند.
با توجه به نیاز روز افزون به این آنزیم در کشور و که کاربردهای وسیعی آنزیم پروتئاز قلیایی در صنایع مختلف دارد و مزایایی که مخمرها نسبت به سایر میکروارگانیسمهای تولید کننده آنزیم پروتئاز قلیایی دارند، به نظر میرسد که برای تکمیل این پژوهشها و شناسایی مخمرهای بومی مولد آنزیم ادامه این پژوهشها امری ضروری است. میکروارگانیسمهای تحمل کننده قلیا به طور مطلوب در pH بین 8 و 9 رشد میکنند ولی قادرند تحت شرایط خنثی نیز رشد کنند .چنین گونههایی معمولا نمیتوانند درpH های بالای 9,5 رشدکنند. بر خلاف این گروه، قلیادوستهای اجباری در pH های خنثی رشد نمیکنند و اغلب pH مطلوب بالای 10 دارند. البته پروتئازهای قلیایی فقط توسط باکتریهای قلیادوست تولید نمیشوند، برای مثال دو پروتئاز قلیایی که کار زیادی بر روی آن ها صورت گرفته است سوبتیلین کارلس برگ میباشندکه بوسیله سویههای خنثی دوست باسیلوس سوبتیلیس تولید میشوند و pH مطلوب آنها 9 تا 11 و نقطه ایزوالکتریک 9 تا 10میباشد
پروتئازهای قلیایی تولید شده بوسیله سویههایباکتریایی باسیلوس
باکتریها برجسته ترین گروه از تولید کننده های پروتئازهای قلیاییاند و جنس باسیلوس مهمترین منبع تولید کننده آن است.
سویههای باسیلوس به طور عمده دو گروه از پروتئازهای قلیایی و خنثی را تولید میکنند .[ 18] پروتئازهای باکتریایی خنثی در دامنه pH باریکی فعالیت دارند - 5 تا - 8 و نسبت به گرما تحمل نسبتا کمی دارند. این ویژگی برای کنترل فعالیت آنها در طی تولید هیدرولیزاتهای غذایی با یک درجه پایین از هیدرولیز مفید میباشد
.پروتئازهای باکتریایی خنثی در تولید پروتئین هیدرولیزیت نسبت به پروتئازهای حیوانی تلخی کمتری ایجاد میکنند و به این دلیل برای استفاده در صنایع غذایی ارزشمند میباشند. سویههای باسیلوس بیشماری از محیطهای مختلف به منظور تولید پروتئاز کشف و به کار گرفته شدهاند ولی بیشترین پتانسیل تولید پروتئازهای قلیایی متعلق به سویههای B. majovensis ، B. amyloliquefaciens، B. subtilis و B. licheniformis میباشند.
باکتریهای متعلق به جنس باسیلوس مهمترین متبع تولید کننده چندین آنزیم تجاری هستند. باسیلوسها باکتریهای میلهای شکل، گرم مثبت، تولید کننده اسپور، هوازی، معمولا کاتالاز مثبت و کمو ارگانوتروف هستند .[8] در سال 1971 میلادی تولید یک سرین پروتئاز قلیایی را از یک باسیلوس قلیا دوست گزارش شد. این سویه که از خاک ایزوله شده بود مقادیر زیادی پروتئاز قلیایی تولید میکرد که با پروتئازهای گروه سوبتیلیزین تفاوت داشت. علاوه براین انواع مختلفی از پروتئازهای قلیایی تعیین ویژگی برخی از پرونئازهای قلیایی و پتانسیل آن ها درکاربردهای صنعتی کشف شده است
کاربردهای صنعتی پروتئازهای قلیایی تولید شده توسط سویههای باسیلوس در مواد غذایی
پروتئازهای قلیایی قادر به هیدرولیز پروتئین های گیاهی و جانوری و در نتیجه تولید پروتئین هیدرولیزیت هایی با الگوی مشخص پپتیدی از آن ها میباشند. این هیدرولیز های پروتئینی نقش مهمی را در تنظیم فشار خون ایفا میکنند و در ترکیب غذای نوزادان، محصولات رژیمی درمانی خاص و به منظور تقویت آب میوهها و نوشیدنیها به کار رقته اند. در سالهای اخیر علاقه قابل توجهی به گسترش روشهای آنزیمی برای هیدرولیز پروتئین سویا، ژلاتین، کازئین، آب پنیر و دیگر پروتئینها به منظور تهیه پروتئین هیدرلیزهای با ارزش غذایی بالا ایجاد شده است. برای تولید تجاری اینگونه محصولات دستیابی به بازده تولید بالا، طعم مناسب و خواص غذایی یا عملکردی مطلوب مورد تاکید میباشد
پروتئاز قلیایی تولید شده توسط باسیلوس لیکنی فرمیس برای تولید پروتئین هیدرولیزیت های با خواص عملکردی بالا مورد استفاده قرار گرفته است. این پروتئاز قلیایی تجاری که آلکالاز نامیده می شود برای تولید پروتئین هیدرولیزیت های با تلخی کم و یا بدون تلخی مانند تولید پروتئین هیدرولیزیت از آب پنیر مورد استفاده قرار گرفته است . البته در بیشتر موارد دیگر نظیر تولیدات دامی و غلاتی استفاده میشود که مستلزم توضیحات بیشتر میباشد.
