مقاله تولید بیوامولسیفایر از میکروارگانیسم های دریایی

بخشی از مقاله

چکیده :

این مقاله میکروارگانیسم هاي تولید کننده بیوامولسیفایر و بیوسورفاکتانت ها را بررسی میکند. میکروارگانیسم هاي دریایی از قبیل: Acinetobacter, Arthrobacter, Pseudomonas, Halomonas, Myroides, Corynebacteria, Bacillus, Alteromonas sp و - EPS - exopolysaccharides براي تولید BS/BE مورد مطالعه قرار گرفته اند. این میکروارگانیسم ها قادر به تولید متابولیت هاي منحصر به فرد هستند که داراي کاربردهاي مختلف می باشند. کشف میکروارگانیسم هاي دریایی تولیدکننده ي BS/BE هاي قوي ، استفاده از مولکول هاي فعالِ سطحِی زیست تخریب پذِیر محیط زیست را افزایش و وابستگی کامل و یا تعدادي از کاربردهاي سورفاکتانت هاي سنتزِي شیمیایی و صنعتی را کاهش داده است. روش هاي مختلف غربالگري براي انتخاب باکتري هاي دریایی جهت تولید بیوسورفاکتانت عبارتند از: روش همولیتیک,اسلاید شیشه اي کج ,روش پلیت آگار آبی,پوشش آگار هیدروکربنی,روش گسترش نفت که کارایی این روش ها در تشخیص باکتري هاي دریایی تولید کنندة بیوسورفاکتانت مورد بررسی قرار گرفته است.

واژه هاي کلیدي : Acinetobacter calcoaceticus ، بيوامولسيفاير، ميکروارگانيسم ھاي دريايی

مقدمه:

ترکیبات فعال سطحی مانند امولسیفایرهاي مصنوعی براي چندین دهه است که به منظور تخریب هیدروکربن و افزایش دفع فلزات متصل به خاك مورد استفاده قرار می گیرند. با این حال با توجه به سمیت بالا ، تجزیه پذیري کم و هزینه هاي تولید که مقرون به صرفه نیست ، براي استفاده در اکوسیستم هاي بزرگتر به تدریج توسط امولسیفایر هاي مشتق شده از منابع طبیعی مثل گیاهان یا میکروب ها جایگزین شده اند . میکروارگانیسم هاي تولید کننده ي مولکول هاي فعال زیستی در همه جا موجود هستند . در آب - دریا ، آب شیرین و آبهاي زیرزمینی - و هم در زمین - خاك ، لجن و رسوب - و همچنین محیط هایی مثل - مخازن نفت و مکان هاي بیش از حد شور - ساکن می باشند و در طیف وسیعی از درجه حرارت و pH و شوري به خوبی رشد می کنند. این میکرو ارگانیسم ها - باکتري ها ، مخمرها ، قارچ ها - به علت داشتن گروه هاي آبدوست و آبگریز تولید بیوسورفاکتانت می کنند .

نیمه هیدروفیل آنها عمدتاً شامل اسید ،کاتیون هاي پپتیدي یا آنیون هاي مونو ، دي یا پلی ساکارید ي باشد در حالی که نیمه آبگریز آنها می تواند یک زنجیره ي هیدروکربن غیر اشباع یا اشباع یا اسید هاي چرب باشد . این ترکیبات طیف گسترده اي از مولکول هاي ساختاري متنوعند که اغلب براساس ویژگی هاي ساختاري و ارگانیسم هاي تولید کننده و جرم مولکولی طبقه بندي می شوند. در طی تکامل تدریجی باکتري خود را به تغذیه از مواد غیر قابل امتزاج در آب ، بوسیله ي تولید و استفاده از یک فراورده فعال سطحی سازگار می کند که به باکتري هاي موجود در فاز آبی در جذب سطحی، emulsify یا به حالت تعلیق درآوردن ،مرطوب کردن و پراکنده کردن یا حل کردن مواد غیر قابل امتزاج در آب کمک می کند .

بیوسورفاکتانت ها عمدتا ترکیبات با وزن مولکولی کم هستند و متشکل از گلیکولیپید و برخی از لیپوپپتیدهاي زنجیرکوتاه می باشند در حالی که بیوامولسیفایرها پلیمرهاي با وزن مولکولی بالا و لیپوپپتیدها هستند. همه اینها برخی ویژگیهاي فعال سطحی دارندکه منجر به کاهش کشش سطحی - SFT - وکشش بین سطحی - IFT - میشوند. این ترکیبات با تشکیل میسل در سطح مشترك مایعات غیرقابل اختلاط مانند آب و روغن توسط کاهش کشش سطحی و کشش بین سطحی و مسدود کردن پیوند هیدروژنی و اثر متقابل آبدوستی و آبگریزي عمل می کنند.

مواد و روش ها :

چندین روش غربالگري براي تشخیص تولیدکنندگان BS/BE وجود دارد که شامل همولیز اریتروسیت ها، آبگریزي سطح سلول، سقوط یا متلاشی شدن قطره ، گسترش نفت ، اسلاید شیشه اي کج، پلیت آگار آبی، فعالیت امولسیون کنندگی، روش پلیت آگار و کروماتوگرافی - TLC - می باشند این روش ها براي غربالگري ،تشخیص و یا ارزیابی پتانسیل میکروارگانیسم هاي تولید کننده BS/BE استفاده میشود. هر کدام از این روش ها مزایا و معایب خود را دارند که در زیر مورد بحث قرار میگیرد:

- 1 روش پلیت آگار پوشیده شده با هیدروکربن : در این روش ایزوله هاي خالص به مدت یک هفته در دماي مطلوب در پلیت آگار پوشش داده شده با نفت انکوبه می شوند. کلنی هایی که توسط هاله امولسیونی احاطه می شوند به عنوان تولیدکنندگان BS شناسایی می شوند. این روش یک روش کارآمد است که در آن مشاهده هاله امولسیونی در سراسر محیط کشت نشانه اي مستقیم از تولیدکنندگان BS است - Satpute et . - al.,2010

- 2 روش : Aximetric drop shape analysis - ADSA - این تکنیک زاویه تماس و همچنین کشش سطحی را براي یک قطره مایع ساکن روي یک سطح جامد تعیین میکند. سلول ها در محلول بافر یا محیط کشت براث به حالت سوسپانسیون یا معلق میباشند.
در نتیجه قطرات سوسپانسیون در سطح فلورو اتیلن پروپیلن قرار می گیرد و پروفایل یا مشخصات یک قطره با شمارنده مانیتور به عنوان تابعی از زمان تا 2 ساعت تعیین می شود. SFT یا کشش سطحی سوسپانسیون توسط مشخصات قطره که به روش ADSA بدست می آید محاسبه می شود. تنها سوسپانسیون تولیدکنندگان BS در مقدار کشش سطحی کاهش نشان می دهند که این مسئله وابسته به غلظت محصول و یا تعداد میکروارگانیسم هاي تولید کننده BS است. این روش یک روش بسیار عالی است که نیاز به تعداد بسیار کوچکی از سلول ها دارد - . - Satpute et al.,2010

- 3 روش پلیت آگار آبی یا : Blue agar plate method این روش به طور ویژه براي تشخیص گلیکولیپیدها از قبیل rhamnolipids که توسط Pseudomonas sp تولید می شود توسعه یافته است. می توان از این روش براي تشخیص نوع مشابهی از BS ها که از سایر ایزوله هاي گرم منفی بدست می آید استفاده کرد. محیط کشت Mineral salts agar medium - MSA - با منبع کربن - %2 - و ستیل تري متیل آمونیوم برمید - CTAB: - 0.0005% - متیلن بلو - MB: 0.0002% - تکمیل می شود. بیوسورفاکتانت هاي آنیونی به شکل جفت یون هاي نامحلول با CTAB-MB کاتیونی تشکیل هاله اي به رنگ آبی تیره در سرتاسر محیط کشت می دهند که براي تولید BS ، مثبت در نظر گرفته می شود. به طور کلی این روش به عنوان یک روش عالی براي تشخیص BS هاي گلیکولیپیدي مورد استفاده قرار می گیرد - . - Satpute et al.,2010

- 4 فعالیت همولیتیک : این روش یک آزمون غربالگري کیفی براي شناسایی و تشخیص تولیدکنندگان BS است. از محیط کشت هاي جامد مانند : Luria agar - LA - و nutrient agar - NA - که 5% خون تازه به آن ها ضمیمه می شود استفاد می گردد. ایزوله ها به مدت 48 ساعت در درجه حرارت مناسب انکوبه می شوند. بازرسی چشمی براي مشاهده همولیز ممکن است لیز شدن سلول هاي قرمز خون به علت پارگی غشاي سلولی ناشی از حضور مولکول هاي فعال سطحی را نشان دهد. Blood agar یک محیط کشت کمپلکس است از این رو انجام تست بهره وري یا قابلیت تولید بیوسورفاکتانت یک کشت در شرایط کشت مختلف به طور مستقیم بر روي آگار بسیار دشوار است. با این حال فعالیت همولیتکی یک معیار غیر قابل اطمینان براي تشخیص بیوسورفاکتانت می باشد - . - Satpute et al.,2010

- 5 روش سقوط قطره اصلاح شده یا : Modified drop collapse method پلیت هاي میکروتیتر - - Microtitre با پوشش نازکی از Pennzoil پوشش داده می شوند. یک نمونه ي 5 μL از محیط کشت براث به مرکز لام اضافه شده و مشاهدات به مدت 1 دقیقه انجام شده است. اگر قطره اي از یک نمونه پوشش داده شده با نفت فرو ریزد نشانه اي از حضور BS درمحیط است - . - Satpute et al.,2010

- 6 روش گسترش نفت یا : Oil spread method در یک پلیت پتري 20 μL نفت خام به 50 mL آب مقطر اضافه می شود. 10 μL از محیط کشت براث بر روي سطح آب مقطرِ آغشته به نفت اضافه می شود. کلنی هایی که توسط هاله امولسیونی احاطه شده باشند براي تولید BS مثبت در نظر گرفته می شوند. این روش یکی از بهترین روش ها براي شناسایی حضور تولید کنندگان BS است - . - Satpute et al.,2010

- 7 تست اسلاید شیشه اي کج یا : Tilted glass slide test ایزوله ها به مدت 24 ساعت روي پلیت آگار رشد کرده اند. نمونه اي از کلنی با یک قطره از NaCl 0.9% در یک اسلاید شیشه اي مخلوط می شوند. اسلاید کج نگه داشته شده و قطره مشاهده می شود. با مشاهده سقوط قطره به سمت پایین میکروارگانیسم هاي تولید کننده BS شناسایی می شوند. این روش مؤثرتراز روش سقوط قطره است - . - Satpute et al.,2010

: Direct colony-thin layer chromatographic - TLC - technique - 8 در این روش یک توده باکتریایی به طور مستقیم روي صفحه پیشرفته ي - chloroform; methanol; 2:1 - TLC قرا می گیرد . بعد از خشک شدن توده ي باکتریایی صفحه در chloroform; methanol; 5 M ammonia - 85:25:4 v/v - حرکت می کند. نتیجه ي کروماتوگرافی مشخصات ترکیب لیپیدي میکروارگانیسم را نشان می دهد. این روش سریع و آسان و بدون هیچ نیاز ویژه اي انجام می شود - . - Satpute et al.,2010

- 9 روش سنجش امولسیفیکاسیون یا : Emulsification assay - EA - محیط کشت براث در 10,000 rpm/15 min/RT سانتریوفوژ می شود. - 3 mL - از مایع رویی با نفت /هیدروکربن - 0.5 mL - مخلوط شده و به مدت 2 دقیقه شدیداً و به حالت گردبادي چرخانده می شود.سپس به مدت یک ساعت دست نخورده باقی می ماند تا فاز آبی و روغن جدا شوند .محیط کشت براث تلقیح نشده به عنوان شاهد استفاده می شود. جذب کنندگی فاز آبی با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر اندازه گیري می شود. مقدار جذبِ 0.01 واحد در طول موج 400 نانومتر توسط فاکتور رقت ضرب می شود و به عنوان یک واحد از فعالیت امولسیفیکاسیون در هر میلی لیتر - EU/mL - در نظر گرفته می شود.

- 10 نمایه ي امولسیفیکاسیون : Emulsification index - EI - فعالیت امولسیفیکاسیون با محاسبه - EI - اندازه گیري می شود. نفت سفید به محیط کشت براث اضافه شده - 1:2 v/v - و به مدت 2 دقیقه چرخانده می شود و اجازه داده می شود تا 24 ساعت ساکن بماند. ارتفاع امولسیون با در نظر گرفتن لایه ي تشکیل شده بین لایه ي آبی و نفت سفید اندازه گیزي می شود. ثبات - EI - قدرت یک سورفاکتانت را تعیین می کند - Satpute et . - al.,2010

- 11 استفاده از روش سنجش کدورت یا : Turbidity assay این روش توسط Rosenberg et al . - 1979 - توسعه داده شده است و بعد ها توسط Neu and Poralla - 1990 - اصلاح شده است . محیط کشت براث فیلتر شده و خشک می شود و سپس به یک بافر اضافه می شود. به علاوه چگالی نوري optical density - OD - در طول موج 446 nm اندازه گیري می شود. به این منظور هیدروکربن اضافه شده و مخلوط به مدت 2 دقیقه چرخانده می شود . اجازه داده می شود به مدت 10 دقیقه بماند و دوباره - OD - اندازه گیري می شود. - EA - از تفاوت بین - OD - اولیه و نهایی اندازه گیري می شود - . - Satpute et al.,2010

- 12 اندازه گیري کشش سطحی با استفاده از کشش سنج - : - Tensiometeric measurement of SFT این روش یکی از روش هاي متداول است. روش هاي Wilhelmy plate, DuNouy ring , maximum pull force تاکنون براي اندازه گیري SFT شناخته شده اند. عصاره آزاد شده از سلول براي اندازه گیري کشش سطحی مورد استفاده قرار می گیرد. اندازه گیري کشش سطحی در سطح غربالگري اولیه براي تعداد زیادي از ایزوله ها عملی نیست - . - Satpute et al.,2010

- 13 ابزارهاي مولکولی براي شناسایی ژن هاي تولید کننده ي بیوسورفاکتانت : کاربرد هاي بیوتکنولوژي براي متودولوژي غربالگري افزایش یافته است. تیم تحقیقاتی Hsieh et al. - 2004 - از مکان ژنیِ sfp مبتنی بر روش PCR براي تشخیص تولید بیوسورفاکتانت از B. amyloliquefaciens وB. Amyloliquefaciens استفاده کردند. این روش روش هاي غربالگري معمولی را تائید می کند. چنین روش هاي تصدیق روش هاي غربالگري معمولی خواهد بود. به همین نحو P. rugulosa NBRC 10877 به عنوان تولید کننده ي چربیِ mannosylerythritol براساس توالی rDNA مشخص شد. جستجوي ژن هاي درگیر در تولید بیوسورفاکتانت سریعتر و کم زحمت تر است - . - Satpute et al.,2010

- 14 روش آبگریزي سطح سلول : یک ارتباط مستقیم بین آبگریزي سطح سلول و تولید بیوسورفاکتانت وجود دارد. سلول ها توسط سانتریفوژ - 12,000g/30 min/4°C - برداشت شده و دوبار با 50 mM بافرفسفات - pH 7.0 - شسته شده و با استفاده از همان بافر براي جذب - A600 - از 0.5 دوباره به حالت تعلیق - سوسپانسیون - درمی آید. سوسپانسیون سلول هاي - 3 mL - به هیدروکربن هاي - 0.5 mL - اضافه شده و به مدت 3 دقیقه به صورت گردبادي چرخانده می شود و اجازه داده می شود به مدت 10 دقیقه ساکن بماند تا فاز هیدروکربن به طور کامل به سمت بالا بیاید. فاز آبی جدا شده و براي اندازه گیري A600 به کووت 1mL - cuvette - منتقل می شود. درصد آبگیري به شرح زیر محاسبه می شود: H% =[ - A0 − A - ]/A0 X 100 که در آن A0 وA به ترتیب بیانگر A600 قبل و بعد از مخلوط کردن با هیدروکربن هستند. بسته به رفتار جذب هیدروکربن، میکروارگانیسم ها ممکن است آبگریزي سطح بالا یا کم داشته باشند. به طور کلی آن دسته از میکروب ها که می توانند هیدروکربن را به حالت جذب مستقیم دریافت کنند آبگریزي سطح بالایی را نشان می دهند. از سوي دیگر Bouchez-Naïtali و همکارانش - 1999 - ثابت کردند که میکروب ها زمانی که BS/BE خارج سلولی آزاد می کنند آبگریزي سطح کمی نشان می دهند که در آن جذب هیدروکربن از طریق BS متوسط است . - Satpute et al.,2010 -

نتایج و بحث :

بیوسورفاکتانت ها به انواع مختلفی از قبیل لیپوپروتئین ،گلیکولیپید ، لیپوپپتید ، فسفولیپید ها و اسید هاي چرب و بیوسورفاکتانت هاي پلیمري و اگزوپلی ساکارید ها طبقه بندي می شوند. همچنین این مولکول ها را می توان به دو دسته ي عمده از قبیل وزن مولکولی بالا و وزن مولکولی پایین طبقه بندي کرد . بیوسورفاکتانت هاي با وزن مولکولی بالا وزن مولکولی بالاتر از 1 MDa دارند که اغلب شامل پلی ساکارید هاي آمفی فیلیک ، پروتئین ، لیپوپلی ساکارید ها و لیپوپروتئین ها هستند که به ثبات امولسیون روغن در آب کمک می کنند. بیوسورفاکتانت هاي با وزن مولکولی پایین نیز وزن مولکولی 1-2 KDa دارند که شامل گلیکولیپید و لیپوپپتید هستند که به طور مؤثر کشش سطحی و کشش بین سطحی را کاهش می دهند. میکروارگانیسم هایی که تولید بیوسورفاکتانت - BSs - می کنند عمدتا ترکیبات با وزن مولکولی کم و برخی از لیپوپپتیدهاي زنجیر کوتاه هستند . انواع با وزن مولکولی پایین وگلیکولیپیدي مثل : - trehalose tetraesters, dicorynomycolates, fructose lipids, sophorolipids and rhamnolipids -

یا لیپوپپتیدي مثل - - surfactin and viscosin هستند . در حالی که بیوامولسیفایرها پلیمرهاي با وزن مولکولی بالا و از لیپوپپتیدها مثل لیپو پلی ساکارید یا لیپوپروتئین یا ترکیبی از این ها هستند . نیمه ي آبگریز لازم براي امولسیون سازي می تواند پروتئینی باشد مثل بیوامولسیفایرِ BD4 emulsan که از باکتريِ Acinetobacter calcoaceticus BD4 تولید می شود یا کربوهیدرات باشد مثل بیوامولسیفایرِ liposan که از Candida lipolytica تولید می شود و یا لیپیدي باشد مثل emulsan که از A.calcoaceticus RAG-1 تولید می شود. اگزوپلی ساکارید ها نیز یک گروه مهم از بیوسورفاکتانت هاي دریایی هستند که پلیمرهاي کربوهیدراتی با وزن مولکولی بالا می باشند.

بسیاري از میکروارگانیسم هاي دریایی تولید پلیمرهاي خارج سلولی می کنند که یک لایه در اطراف سلول ها تشکیل می دهند و آنها را در برابر شرایط نامطلوب زیست محیطی مقاوم می کند. جنس هاي مختلف از قبیل آلکالیژنس ، سودوموناس، هالوموناس ، انتروباکتر انواع مهمی از تولیدکنندگان بیوسورفاکتانت از نوع اگزوپلی ساکارید می باشند. به عنوان مثال سویه ي pseudomonas putida ML2 تولید اگزوپلی ساکارید می کند که از رسوبات آلوده به هیدورکربن در طی رشد در سوبستراي هیدروفوبیک جداسازي شده و در فاز ثابت و نمایی تولید امولسیفایر می کند. امولسیفایر خام به دست آمده تقریباً وزن مولکولی10-80 KDa را دارد. در جدول شماره - 1 - انواع مهم امولسیفایر هاي میکروبی ذکر شده است.