بخشی از مقاله
چکیده:
اخیراً لیپازها، بدلیل کاربردهاي جدید وگوناگونی کهدر صنایع غذایی و دارویی، صنایع روغنی، سنتز ترکیبات آلی و فرمولاسیون دترجنت ها دارند، بعنوان آنزیم هاي کلیدي در بیوتکنولوژي مطرح هستند. لیپازها یا تري آسیل گلیسرول هیدرولازها - EC 3.1 .1.3 - ، آنزیم هایی هستند که هیدرولیز تري گلیسریدها را به اسیدهاي چرب و گلیسرول کاتالیز می کنند و توسط انواع مختلف باکتري ها، قارچ ها و مخمرها تولید می شوند.
هدف از این مطالعه، جداسازي سریع باکتري هاي ترموفیل مولد آنزیم لیپاز از یک نمونه پساب داغ حاوي مقادیر زیاد نشاسته و روغن، با استفاده از محیط پایه نمکی حاوي روغن زیتون بعنوان تنها منبع کربن می باشد. فرآیند جداسازي از طریق رقت سازي نمونه هاي بدست آمده از محیط پایه نمکی و کشت بر روي پلیت هاي تري بوتیرین آگار TBA انجام شد. همچنین به منظور تمایز بین کلنی هاي تولید کننده لیپاز و استراز، کلنی هاي داراي هاله شفاف بر روي محیط TBA، روي محیط رودامین ب آگار کشت داده شدند.
کلنی هاي مثبت براي سنجش میزان فعالیت لیپازي، به محیط تولید LBO ، تلقیح و در دماي 60°c و دور 150 rpm گرماگذاري شدند. فعالیت لیپازي عصاره آنزیمی بوسیله روش اسپکتروفتومتري و با استفاده از پارانیتروفنیل پالمیتات بعنوان سوبسترا در 410 نانومتر اندازه گیري شد. سویه اي که بیشترین فعالیت لیپازي برابر 27/4 U/L را در میان 15 سویه غربال شده نشان داده بود، براي بررسی هاي بیشتر انتخاب شد. این سویه بر اساس ویژگی هاي مورفولوژیکی و خصوصیات بیوشیمیایی به جنس باسیلوس تعلق می گیرد.
مقدمه:
لیپازها یا تري آسیل گلیسرول هیدرولازها - EC 3.1.1.3 - 1 ، آنزیم هایی هستند که در حد فاصل فاز آبی-آلی عمل می کنند و هیدرولیز چربی ها و مونو و دي گلیسریدها را به اسیدهاي چرب و گلیسرول کاتالیز می کنند. در حال حاضر اغلب لیپاز هاي تجاري، منشا میکروبی دارند و میکروارگانیسم هاي بسیاري مانند باکتري ها، مخمرها و قارچ ها شناخته شده اند که که طی رشد بر روي سوبستراهاي هیدروفوب قادر به تولید آنزیم لیپاز خارج سلولی هستند که این امر سوبستراي لیپیدي را در اختیار سلول ها قرار می دهد. محققینی مانند Schmidt و همکارانش - 1994 - ، - 1997 - Luisa و - 2007 - Limpon، جداسازي چندین گونه باسیلوس مولد آنزیم لیپاز را گزارش کرده اند. - - 1
لیپاز هاي میکروبی از نظر کاربرد در بیوتکنولوژي و در صنایع مختلف اهمیت بسیاري پیدا کرده اند زیرا این آنزیم ها قادرند طیف وسیعی از واکنش هاي هیدرولیز و سنتزي مانند واکنش هاي استریفیکاسیون و ترانس استریفیکاسیون را کاتالیز کنند، سوبستراهاي متنوعی را مورد استفاده قرار دهند و پایداري قابل ملاحظه اي را در حلال هاي آلی داشته باشند. از سوي دیگر، لیپازهاي مقاوم حرارتی بدست آمده از میکروارگانیسم هاي ترموفیل بدلیل کاربرد ویژه شان در صنایع غذایی براي تغییر و تبدیل ترکیبات لیپیدي، در شوینده ها و در تیمار پساب هاي روغنی بسیار مورد توجه قرار گرفته اند. - - 2 در این مطالعه هدف، جداسازي سریع باکتري هاي ترموفیل مولد آنزیم لیپاز از پساب روغنی کارخانه تولید چیپس با استفاده از محیط حاوي روغن زیتون می باشد .
مواد و روش ها:
جداسازي سویه هاي مولد آنزیم لیپاز
از پساب داغ حاوي روغن با دماي 82°c و pH برابر6، در ظروف استریل نمونه برداري شد. از این نمونه ها به میزان %5 به محیط پایه نمکی با ترکیب %6 K2HPO4 ، %3 KH2PO4، 0/2 MgSO4 %، %5 NH4 Cl، حاوي %1 روغن زیتون بعنوان تنها منبع کربن تلقیح شد و در دماي 65 °c و دور شیکر150 rpm به مدت 11 روز انکوبه شد و هر 24 ساعت از این محیط نمونه برداري و سري رقت تهیه شد و روي محیط تري بوتیرین آگار با ترکیب پپتون %0/5 ، عصاره مخمر %0/3، تري بوتیرین مایع %1 و آگار % 1/5 با pH= 7 برده شد.
پلیت هاي تري بوتیرین آگار به مدت 72 ساعت در دماي 60°c انکوبه شدند و هر 24ساعت، کلنی هاي حاصل از نظر تشکیل هاله بررسی شدند. کلنی هاي داراي هاله شفاف بر روي محیط تري بوتیرین آگار، انتخاب شده و بر روي محیط نوترینت آگار با ترکیب پپتون % 0/5 و عصاره گوشت %0/3 و آگار % 1/5 خالص سازي شدند. به منظور تمایز کلنی هاي مولد لیپاز از کلنی هاي مولد استراز، ازمحیط رودامین ب آگار با ترکیب نوترینت براث %0/8، سدیم کلراید 0/4 %، روغن زیتون %2/5 ، محلول رودامین ب - غلظت %1 - 1 mg/ml و آگار %1 با pH= 7 استفاده شد. .
غربال گري سویه هاي جدا شده از نظر فعالیت لیپولیتیک و تولید آنزیم
به منظور تولید آنزیم لیپاز توسط سویه هاي جدا شده، از محیط تولید LBO مایع با ترکیب پپتون %1، عصاره مخمر % 0/5 ، سدیم کلراید %1 ، روغن زیتون %1 و تویین%0/05 80 با pH اولیه 7 استفاده شد. از کشت هاي باکتریایی تازه 24 ساعته روي اسلنت به 100 ml محیط تولید LBO در ارلن شیاردار 500 ml تلقیح و در دماي 60 °c و دور 150 rpm گرماگذاري شد و میزان تولید لیپاز در این محیط طی 72 ساعت هر 24 ساعت مورد سنجش قرار گرفت.
سنجش فعالیت آنزیم لیپاز
با سانتریفیوژ محیط تولید در 12000 rpm به مدت 20 دقیقه در 4°c، سلول هاي باکتریایی از محیط جدا شده و سوپرناتانت حاصل پس از فیلتراسیون با فیلتر0/45 ، بعنوان عصاره آنزیمی مورد استفاده قرارگرفت. فعالیت لیپازي با استفاده از پارا نیتروفنیل پالمیتات - - pNPP که یک سوبستراي کروموژن است سنجیده شد. براي تهیه مخلوط واکنش سنجش فعالیت، 3 میلی گرم پارا نیتروفنیل پالمیتات را در 1 ml ایزوپروپانول حل کرده و این محلول به 9 ml بافر pH= 8 - Tris–HCl، - 50 mM حاوي 0/01 g صمغ عربی، 0/02 g سدیم داکسی کلات و Triton X-100 0/04 ml افزوده می شود. 700 l از مخلوط واکنش با 300 l عصاره آنزیمی مخلوط و در دماي 60 °c به مدت 15 دقیقه انکوبه می گردد و میزان جذب در طول موج 410 nm خوانده می شود. بر طبق این روش، یک واحد - U - فعالیت آنزیمی برابر مقدار آنزیمی تعریف می شود که بتواند 1 mol پارانیتروفنول را در مدت یک دقیقه از سوبستراي pNPP آزاد سازد.
نتایج :
-1 انتخاب سویه هاي لیپولیتیک
از میان کل سویه هاي جدا سازي و خالص شده از محیط پایه نمکی، 15 سویه بر روي محیط تري بوتیرین آگار TBA، هاله شفاف بزرگ و قابل ملاحظه اي تشکیل دادند. این 15 سویه بر روي محیط رودامین ب آگار نیز، کلنی هاي فلورسنت نارنجی رنگ زیر نور UV با طول موج 350 nm داشتند که این امر نشان می دهد که این 15 سویه مولد لیپاز حقیقی هستند و هاله تشکیل شده بر روي محیط TBA، با تجزیه تري بوتیرین موجود در محیط بر اثر ترشح لیپاز بوده است نه استراز. در محیط رودامین آگار با هیدرولیز روغن زیتون موجود در محیط، اسید هاي چرب آزاد می شوند که با رودامین ب، بطور اختصاصی تشکیل کمپلکس فلورسنت نارنجی می دهند که در زیر نور - = 350 nm - UV قابل مشاهده است در حالی که باکتري هاي مولد استراز در زیر نور UV، کلنی صورتی بر روي این محیط می دهند.
