بخشی از مقاله
چکیده
پلیهیدروکسیبوتیرات 1 - PHB - پلیاستری از اسیدهای چرب است که به عنوان منبع کربن و انرژی در سیتوپلاسم باکتری ذخیره می-شود، تا در زمان کمبود مواد غذایی از این ذخیره استفاده شود. این ماده، پلیمری زیستی بوده که از منابع تجدیدپذیر تولید میشود و قابلیت تجزیهپذیری در مدت زمان کوتاهتری نسبت به پلاستیکهای معمول را داشته و به دلیل زیستسازگاری و زیستتخریب پذیری مورد توجه زیادی قرار گرفته است. این پلیمر توسط گونههای مختلفی تولید میشود که یکی از آنها، باکتریهای خانواده هالوفیل هستند. در این پژوهش از باکتری هالوموناس استفاده شده است که آنالیزهای کیفی و کمی برای بررسی تولید این پلیمر دوستدار محیطزیست انجام شد و تولید PHB توسط این گونه، معادل %70 وزن خشک سلولی به دست آمد.
مقدمه
استفاده از پلیمرها و پلاستیکها در اغلب وسایل زندگی از ریزترین آنها گرفته تا بزرگترین آنها انکارناپذیر است. دلیل این استفادهی وافر پلیمرها و پلاستیکها در زندگی انسان خواص بسیار زیاد آنها است .[1] پلیمرهای زیستتخریبپذیر زیادی شناسایی شدهاند و یکی از مهم-ترین آنها پلیهیدروکسیآلکانواتها است. پلیهیدروکسی آلکانوات توسط تعداد وسیعی از ریزسازوارهها تولید میشوند. این ماده به عنوان یک منبع ذخیره کننده انرژی و کربن به صورت درون-سلولی در حضور کربن مازاد و اغلب تحت شرایط کمبود و محدودیت مواد مغذی برای رشد سلولی، تولید میشوند.
پلیهیدروکسیآلکانواتها همچنین میتوانند توسط ریزسازوارههای نمکدوست تولید شوند، که در سه دسته آرکیا، باکتریا و یوکاریا جای میگیرند. بسته به میزان نمک مورد نیاز برای رشد، این ریزسازوارهها به دو دسته تقسیم میشوندشدیداً. نمک دوست که در غلظت - w/v - %15-3 و متعادل نمکدوست که در محدوده %25-0 - w/v - رشد میکنند .[3] این گروه از ریزسازوارهها پتانسیل زیادی برای بهرهبرداری های زیستی دارند که به عنوان منبعی برای آنزیمهای هیدرولیتیکی، پلی-ساکاریدها و پلیهیدروکسیآلکانواتها استفاده میشوند .[4]
مواد و روش ها
معرفی باکتری و طریقه نگهداری آن:
باکتری هالوموناس که از دریاچه ارومیه جداسازی شده است از سازمان پژوهشهای علمی و صنعتی ایران تهیه شد.این باکتری بر روی محیط کشت اختصاصی و با اضافه کردن %1,5 آگار، کشت خطی داده شد و در دمای 4 درجه سانتیگراد نگهداری شد. ترکیبات محیط کشت برای رشد این باکتری شامل - گرم بر لیتر - : کلرید سدیم 80؛ کازآمینو اسید 7,5 ؛ پروتئوس پپتون 5 ؛ عصاره مخمر 1؛ سیترات سدیم 3؛ سولفات منیزیم7آبه 7؛ دی پتاسیم هیدروژن فسفات 0,5؛ سولفات آهن آمونیوم 6آبه 0,05؛ آگار 15 میباشد. برای رشد باکتری pH بر روی 7 تنظیم شد و نمونهها در دمای 30 درجه سانتیگراد و شدت تکاندهی150 به مدت 24 ساعت گرماگذاری شدند.
رسم منحنی رشد باکتری
برای رسم منحنی رشد باکتری با استفاده از روش جذب نوری، ابتدا پس از آمادهسازی محیط کشت باکتری طبق دستورالعمل ذکر شده، pH محیط بر روی 7 با استفاده از NaOH و HCl تنظیم شد و پس از استریل کردن نمونهها %1 از مایه تلقیح تهیه شده به ارلنها اضافه شد و در فواصل زمانی مشخص از ارلنها نمونهبرداری شده و میزان جذب نور توسط باکتری با دستگاه اسپکتوفتومتر - Cary - Win 100 در طول موج 600 نانومتر اندازه گیری شد. پس از رسم منحنی رشد، زمان مربوط به حداکثر رشد باکتری در فاز لگاریتمی مشخص شد و نمونههای میکروبی پس از گذشت 24 ساعت از رشد به اپندرف انتقال داده شده و %10 گلیسرول به آنها اضافه شد و بانک تهیه شده در دمای منفی 70 درجه سانتیگراد نگهداری شد.
روش رنگ آمیزی گرم
برای حصول اطمینان از عدم آلودگی محیط کشت به سایر باکتریها و بررسی شکل ظاهری و گرم منفی یا مثبت بودن گونه، از روش رنگآمیزی گرم استفاده شد. در این روش ابتدا روش کار با استفاده از لوپ در شرایط استریل و زیر هود میکروبی، ی ک قطره از محیط کشت برداشته و روی سطح لام تمیزی قرار داده و پخش میشود، سوسپانسیون میکروبی در دمای محیط روی لام خشک شده و سپس با عبور از روی شعله، باکتری روی لام تثبیت میشود. محلول کریستال ویوله به مدت یک دقیقه روی اسمیر ریخته شده و سپس با آب مقطر سطح لام شستشو داده میشود.
مرحله ذکر شده برای محلول لوگل نیز تکرار می شود و سپس لام توسط محلول الکل-استن تا حذف کامل رنگ بنفش از روی لام شسته میشود. محلول سافرانین روی لام ریخته شده و پس از سی ثانیه با آب مقطر شسته شده و پس از خشک شدن توسط میکروسکوپ نوری مشاهده میشود. باکتریهای گرم مثبت رنگ بنفش به خود گرفته و باکتریهای گرم منفی صورتی رنگ میشوند.
تعیین وزن خشک سلولی
برای تعیین وزن خشک سلولی ابتدا حجم دقیقی از محیط کشت تخمیر به ظروف مخصوص سانتریفوژ منتقل شد و به مدت 15 دقیقه با دور 6000 rpm سانتریفوژ گردید. مایع روایستا دور ریخته شد و به منظور شستشوی سلولها و حذف سایر مواد محیط کشت، رسوب حاصل با آب مقطر به صورت تعلیق درآمده و مجددا ً سانتریفوژ شد. رسوب حاصل که همان توده زیستی است برای تعیین وزن خشک سلولی در آون 80 درجه سانتیگراد به مدت 24 ساعت قرار داده شد تا به وزن ثابت رسید و وزن خشک سلولی محاسبه گردید .[5]
محیط کشت تولید پلیهیدروکسیبوتیرات
همانطور که قبلاً گفته شد PHB پلیمری است که ریزاندامگان آن را به عنوان ذخیره انرژی به صورت درون سلولی در خود ذخیره می کنند. این ذخیره به دلیل کمبود مواد مغذی همچون نیتروژن، فسفر و اکسیژن در حضور مقدار اضافی منابع کربن اتفاق می افتد .[6] به همین منظور در این تحقیق محیط کشت مورد بررسی برای تولید PHB به محیط کشت اختصاصی رشد باکتری شباهت دارد، با این تفاوت که در مرحله تولید PHB، از محدودیت نیتروژن برای تولید PHB با تامین کربن اضافی استفاده شده است ، به طوری که دو منبع تامین نیتروژن حذف و منبع کربن 3 برابر افزایش داده شده است. ترکیبات محیط کشت تولید PHB - گرم بر لیتر - به قرار زیر است. کلرید سدیم 80؛ عصاره مخمر 1؛ سیترات سدیم 3؛ سولفات منیزیم.7آبه 7 دیپتاسیمهیدروژنفسفات 0,5؛ سولفات آهن آمونیوم 6.آبه 0,05؛ میباشد.
سنجش تولید PHB
یکی از روشهای کیفی برای سنجش تولید PHB توسط باکتری، استفاده از رنگ سودان سیاه است که در این روش گونه میکروبی به رنگ قرمز و گرانولهای PHB به رنگ آبی تیره در میآید. روش کمی برای تعیین مقدار این پلیمر در پژوهش حاضر نیز، استفاده از دستگاه کروماتوگرافی گازی است.
روش رنگ آمیزی سودان سیاه
ابتدا گسترش میکروبی تهیه کرده و محلول سودان سیاه که از 0,3 گرم پودر سودان سیاه به اضافه اتانول %70 تشکیل شده است را به مدت 10 دقیقه روی گسترش میکروبی که با شعله تثبیت شده است ریخته میشود. سپس با آب شستشو داده و پس از خشک کردن آن با کاغذ صافی، لام با زایلن تا شفاف شدن کامل شستشو داده می-شود. سپس سطح لام با 0,5 درصد سافرانین به مدت 15-10 ثانیه آغشته شده و پس از شستشو با آب و خشک کردن، باکتریها با لنز 100 میکروسکوپ قابل مشاهده هستند. سلولهای باکتری قرمز رنگ و ذرات PHB به رنگ آبی تیره مشاهده میشوند.
آنالیز پلیهیدروکسیبوتیرات با استفاده از کروماتوگرافی گازی برای آمادهسازی نمونهها برای تزریق به ستون کروماتوگرافی گازی، ابتدا 5 میلیلیتر از محیط کشت تولید PHB، در شرایط سترون از کشت تخمیر به لولههای COD منتقل و با دور 6000rpm به مدت 15 دقیقه سانتریفوژ شده و محلول رویی دور ریخته میشود. به لولههای COD محتوی سلولهای رسوب یافته، 2 میلیلیتر کلروفرم، 0,85میلیلیتر محلول متانول و اسید بنزوییک 40 - میلی گرم اسید بنزوییک - به عنوان استاندارد داخلی - در یک لیتر متانول - و 0,15 میلیلیتر اسیدسولفوریک غلیظ اضافه میشود.
برای تهیه محلول استاندارد خارجی در یک لوله COD تمیز، 2 میلیگرم پلیهیدروکسیبوتیرات استاندارد - آلدریچ - ریخته و مواد و حلالهای یاد شده به آن افزوده میشود. لولهها به مدت 15 دقیقه در همگن کننده فراصوتی قرار گرفتند تا دیواره سلولی باکتری ها شکسته شود. سپس لولهها به مدت 2 ساعت در رآکتور COD در دمای 100 C قرار گرفتند. در این حالت PHB به متیلاستر هیدروکسیبوتیرات تبدیل میشود.
پس از خنک شدن لولههای COD، 1 میلیلیتر آب دو بار تقطیر به هر لوله اضافه شد و به مدت 1 دقیقه با استفاده از همزن لوله به شدت هم زده شد. پس از همزدن، سه فاز تشکیل میشود. فاز آبی در بالا، فاز میانی که بقایای اجزای سلولی است و فاز پایینی یا فاز آلی که کلروفرم حاوی هیدروکسی بوتیرات است. فاز بالا و میانی با استفاده از پیپت پاستور از لوله خارج شده و فاز آلی توسط سمپلر به لوله تمیز دیگری منتقل شد تا محلول شفاف بدون رسوب به دست آید. فاز آلی حاوی متیلاستر به دستگاه کروماتوگرافی گاز تزریق شد تا میزان پلیهیدروکسیبوتیرات اندازه گیری شود - تا قبل از تزریق نمونه به دستگاه کروماتوگرافی گاز میتوان آن را در یخچال نگهداری کرد - .[7]
مشخصات دستگاه کروماتوگرافی گاز
در این پژوهش از دستگاه گروماتوگرافی گازی PU 4410 Philips با آشکارساز FID استفاده شد. برای جداسازی از ستون مویینه از جنس پرمانوپروپیل فنیل دی متیل سیلوگزان %14، Bp5 با طول 25 متر و قطر 0,32 میلیمتر استفاده شد. برنامه داده شده به دستگاه شامل دمای آشکارساز 280 C، دمای محل تزریق 250 C ، دمای ستون 70 C به مدت 2 دقیقه، دمای اولیه بالای ستون 100 C و دمای ثانویه بالای ستون 200 C بود.
نتایج
برای حصول اطمینان از عدم آلودگی محیط کشت به باکتری دیگر حین عمل تخمیر، روش رنگ آمیزی گرم مورد استفاده قرار گرفت. باکتریها، میلهای شکل به رنگ صورتی درآمده و گرم منفی بودن این گونه را تایید کرده و هیچ گونه دیگری با شکل دیگر و یا با رنگ بنفش دیده نشد و تمام سطح لام بررسی شده و همه باسیلها یک شکل و یک رنگ همانطور که در شکل 1 قابل مشاهده است دیده شدند.
بررسی سینتیک رشد
سینتیک رشد بدین منظور مورد بررسی قرار گرفت که در مرحله بررسی تولید پلی هیدروکسی بوتیرات باید از رسیدن به فاز سکون آگاه بود. به همین منظور از زمان تلقیح هر 12 ساعت یکبار نمونه گیری انجام شده و میزان جذب نوری نمونهها خوانده شد و منحنی رشد باکتری که در شکل 2 نشان داده شده است، رسم شد. برای آنالیز کیفی تولید PHB، رنگ آمیزی سودان سیاه انجام گردید و باسیلهای تولید کننده PHA به رنگ آبی تیره درآمدند و توده سلولی صورتی رنگ شد که در شکل 3 قابل مشاهده است.
نتیجهگیری و جمعبندی
باکتری هالوموناس در محیط کشت تولید، توانست 1,139 گرم در لیتر، به عبارتی معادل %70 وزن خشک سلولیPHB تولید کند. در این پژوهش، میزان %7 افزایش تولید نسبت به مطالعههای پیشین، برای گونهای مشابه مشاهده گردید. با توجه با این افزایش بازده تولید، استفاده از این گونه در تولید پلیمر بیشتر مفید خواهد بود .[8]
