بخشی از مقاله
چکیده
برنج بعد از گندم نقش مهمی در تأمین غذا و کالری مورد نیاز مردم ایران دارد. انجام تحقیقات بمنظور رفع چالشهای موجود در افزایش و تولید پایدار برنج جزو اهداف راهبردی کشور در جهت حصول به امنیت غذایی و سلامت جامعه میباشد. اصلاح ارقام موجود و معرفی رقمهای جدید با خصوصیات بهبود یافته نیازمند وجود تنوع ژنتیکی در مواد اصلاحی و سازگاری آنها با یکدیگر است. با توجه به فعالیتهای بهزراعی، این تنوع در حال کاهش بوده و نیازمند بکارگیری روشهایی مانند استفاده از مواد شیمیایی و یا پرتوتابی برای ایجاد تغییرات ژنتیکی - تنوع - جدید میباشد.
این روشها غیراختصاص بوده و تغییرات بصورت تصادفی در ژنوم ایجاد میشوند که ممکن است حتی زمان برنامههای اصلاحی را افزایش دهند. استفاده از تکنولوژیهای زیستی جدید برای دستورزی هدفمند ژنوم فارغ از نگرانیهای گیاهان تغییریافته ژنتیکی مرسوم نویدبخش کاهش مدت زمان لازم برای تولید ارقام جدید و مهیا کردن استراتژیهای انتخابی برای دستیابی به امنیت غذایی پایدار را به همراه دارد. در مقاله حاضر انواع روشهای نوین دستورزی ژنوم به اختصار تعریف شده و مثال هایی از کاربرد هر کدام در اصلاح برنج آورده شده است.
مقدمه
برنج - Oryza sativa - یکی از مهمترین گیاهان زراعی است که تغذیه حدود نیمی از مردم جهان به آن وابسته میباشد. از این گیاه بعنوان مدل گیاهان تک لپه برای مطالعه و تجزیه و تحلیل نحوه عملکرد ژن بطور گسترده استفاده میشود. ژنوم برنج در زیرگونههای ژاپونیکا و ایندیکا بطور کامل توالییابی شده و اطلاعات بسیاری برای روش ساختن عملکرد ژن در سطح ژنوم مهیا کرده است. برای ایجاد تنوع و تهیه موتانتهای جدید برنج از مواد جهشزای شیمیایی و جهش زایی با اشعه بطور گسترده استفاده شده است.
با استفاده از این روشها نمیتوان یک ژن خاص را هدف قرار داد و نیازمند کار زیاد برای شناسایی و انتخاب فنوتیپ موردنظر میباشد - الیور، . - 2014 ویرایش ژنوم - تغییر هدفمند یک ژن - ، امکان تولید ترکیبات آللی جدید در ژنوم گونههای زراعی را فراهم میکند، که میتواند جایگزین روشهای اصلاحی استاندارد مبتنی بر نوترکیبی و همچنین ترانسفورماسیون باشد - آنیلی و همکاران، . - 2013 تکنولوژیهای ZFNها - Zinc finger nucleases - ، TALENها - - - Transcription activator-like effector nucleases - TALENs و CRISPRها - Clustered regularly interspaced short palindromic repeats - CRISPRs - - از توانایی منحصر به فرد نوکلئازهای اختصاصی توالی برای ویرایش بسیار دقیق و موثر مولکول DNA یا ژنها استفاده میکنند - بالتس و ویتاس، . - 2015 این تکنیکها نوید دهنده جهش بزرگ در فرایند تولید و معرفی ژنوتیپهای گیاهان زراعی با صفات ارزشمند جدید که دستیابی به آنها در یک بازه زمانی معقول توسط تکنیکهای مرسوم اصلاحی امکانپذیر نیست، میباشند.
نوکلئازهای انگشت روی ZFN - ها -
ZFNها در سال 1996 کشف شدند و بدنبال آن در آزمایشات مهندسی ژنتیک مگس سرکه و سلولهای پستانداران در سال 2002 مورد استفاده قرار گرفتند - بیبیکووا و همکاران، ZFN . - 2003ها متشکل از دمین برش غیراختصاصی DNA از اندونوکلئاز FokI همراه با پروتئینهای "انگشت روی" میباشند. دایمرهای ZFN برش هدفمند در DNA دو رشتهای را القا کرده که منجر به تحریک مسیرهای پاسخ ترمیم DNA میگردد.
خاصیت اختصاصی بودن اتصال دمین "انگشت روی" طراحی شده، ZFN را به سمت جایگاه ژنومی مورد نظر هدایت میکند - اورنف و همکاران، ZFN . - 2010ها نخستین نسل از نوکلئازهای اختصاصی جایگاه میباشند که برای ویرایش ژنوم گیاهان استفاده شدهاند. تحقیقات بسیاری با استفاده از ZFNها در زمینه ویرایش ژنوم انجام گرفته است، با اینوجود بدلیل مشکل و هزینهبر بودن دستورزی ساختارهای ZFN گسترش کاربرد آنها به کندی انجام میشود - سانجانا و همکاران، . - 2012
TALENها
پاتوژن گیاهی زانتوموناس میتواند در حین آلوده کردن گونههای میزبان مختلف، عوامل شبه فعالکننده رونویسی TALE - ها - را ترشح کند که سبب تسهیل آلودگی باکتریایی میشوند. TALE ها دارای چندین دمین تکراری 33 تا 35 اسید آمینهای میباشند که هر کدام از آنها یک باز را تشخیص میدهند. TALENها از ادغام دمین هضمی آنزیم FokI و دمین های متصل شونده به DNA حاصل از پروتئینهای TALE بوجود میآیند. همانند ZFNها، TALENها برش هدفمند در DNA دو رشتهای را القا کرده که پاسخهای ترمیمی سلول را در پی خواهد داشت. استفاده از سیستم TALEN امکان ایجاد تغییرات هدفمند در ژنوم را فراهم میکند - کرماک و همکاران، . - 2011
CRISPRها
CRISPRها جایگاههایی هستند که دارای چندین توالی تکراری مستقیم کوتاه بوده و سبب ایمنی اکتسابی باکتریها و آرکیها در برابر ویروسها یا اسیدهای نوکلئیک خارجی میشوند - بارانگو و همکاران، . - 2007 سیستمهای CRISPR مبتنی بر crRNA - CRISPR RNA - و tracrRNA - trans -activating chimeric RNA - برای خاموش کردن اختصاصی DNA خارجی مهاجم میباشند. سه نوع سیستم CRISPR/Cas وجود دارد که در نوع دوم Cas9 بعنوان یک اندونوکلئاز DNA هدایت شونده با RNA که DNA را با واسطه شناسایی توالی هدف با crRNA-tracrRNA برش میدهد، عمل میکند - کنگ و همکاران، . - 2013
توانایی سیستم CRISPR/Cas9 در دستورزی هدفمند ژنوم بسیاری از گونههای گیاهی مورد بررسی قرار گرفته است - جیانگ و همکاران، 2013 ؛ جیا و همکاران، . - 2014 کاربردهای این سیستم در کشاورزی مشکلات نظارتی کمتری نسبت به کاربردهای پزشکی داشته و انتظار میرود در برخی از بازارها، برگشت بودجه سرمایهگذاری شده به سرعت انجام شود. کمپانی داو آگروساینسز همراه با سانگامو بایوساینسز حقوق مالکیت معنوی توسعه گیاهان زراعی تراریخته با استفاده از Cas9 را در اختیار گرفتهاند. در حالیکه USDA هنوز در زمینه چگونگی رفتار با ژنومهای ویرایش شده با استفاده از Cas9 تصمیمی اتخاذ نکرده اما در حال حاضر ZFNها و TALENها نیازی به نظارت USDA ندارند - گلوریکیان، . - 2015
استفاده از تکنولوژیهای نوین دستورزی ژنوم در برنج
بمنظور تبدیل تکنولوژیهای ویرایش ژنوم به راهکارهای روتین برای تغییر هدفمند ژن در برنج تحقیقات متعددی انجام گرفته است. چن و همکاران در سال 2014 دستورالعملهای لازم برای ایجاد جهش هدفمند در ژنوم برنج با استفاده از سیستم TALEN را ارائه کردند. این دستورالعملها شامل سرهمبندی TALENها با استفاده از سیستم Golden Gate و ساخت ناقلهای بیان گیاهی، تایید فعالیت TALEN در پروتوپلاست برنج، ترانسفورماسیون TALEN در برنج و غربالگری گیاهانی که ژن مورد نظردر آنها خاموش شده، می باشد - چن و همکاران، . - 2014 با استفاده از سیستمهای مبتنی بر TALEN میتوان طیف گستردهای از جهشهای قابل توارث در برنج بمنظور بهبود صفات مهم زراعی تولید کرد - ژانگ و همکاران، . - 2016
در حین انبارداری برنج، دانهها به تدریج زندهمانی خود را از دست داده و طعم کهنهگی بخود میگیرند که سبب خسارت اقتصادی به کشاورزان می شود. لیپوکسیژنازها با دایاکسیژناسیون اسیدهای چرب چند زنجیرهای غیر اشباع در برنج یکی از مهمترین عوامل ایجاد این تغییر می باشند. آنزیم LOX3 نقش مهمی در ماندگاری دانه برنج ایفا میکند. عملکرد بیوشیمیایی، مکانیابی درون سلولی و الگوی بیان ژن lox3 مورد بررسی قرار گرفته و نقش آن در ماندگاری دانه ارزیابی شده است.
ممانعت از بیان ژن lox3 با استفاده از تکنیک آنتیسنس - RNAi - مطالعه شده و افزایش زمان انبارداری دانههای برنج را نشان داده است. در تحقیقات اخیر، ژن lox3 با استفاده از سیستم TALEN خاموش شده و بذرهایی که دارای ژن خاموش شده بودند از قابلیت انبارداری بهتری برخوردار بودند. مزایای سیستم TALEN در مقایسه با روش های مرسوم تولید گیاهان تراریخته و همچنین اصلاح با هیبریداسیون، توانایی تغییر دقیق و اختصاصی ژن مورد نظر میباشد.
در مقایسه با دستورزی ژن با RNAi که ناقص و ناپایدار است، تغییرات اعمال شده توسط سیستم TALEN به نسلهای آتی بصورت پایدار به ارث میرسند. گیاهان حاصل از دستورزی هدفمند با استفاده از سیستم TALEN فاقد ترانسژنهای خارجی بوده و مشابه موتانتهای طبیعی میباشند و از آنجائیکه لاینهای اصلاح شده با TALEN نیاز به چندین نسل غربالگری ندارند به میزان زیادی در زمان صرفهجویی میشود - ما و همکاران، . - 2015
عطر برنج باسماتی و جاسمین بدلیل حضور ترکیب -2 استیل - -1 پیرولین میباشد. واریتههای برنج بدون عطر برخلاف واریتههای معطر دارای مقادیر بسیار اندکی از این ترکیب هستند. یک ژن مغلوب روی کروموزوم شماره 8 برنج به میزان زیادی میزان -2 استیل -1- پیرولین را کنترل میکند. نشانگرهای ژنتیکی برای انتخاب این صفات در برنامههای اصلاحی توسعه یافته است - بردبوری و همکاران، . - 2005 تولید برنج معطر با خاموش کردن هدفمند ژن OsBADH2 توسط سیستم TALEN مورد بررسی قرار گرفته است.
لاینهای برنج تراریخته بدست آمده پس از تفرق در نسل های اول و دوم تنها دارای توالی DNA مورد نظر بوده و ترانسژن TALEN در آنها حضور نداشت. میزان تولید -2 استیل -1- پیرولین در لاینهای تراریخته نسل اول دارای جهشهای هموزیگوس از 0 به 0/35 تا 0/75 میلیگرم در کیلوگرم افزایش یافت که برابر با محتوای آن در لاین کنترل معطر میباشد - شان و همکاران، . - 2015 با استفاده از سیستم TALEN با تغییر هدفمند باز در توالی DNA و نوترکیبی همولوگ، برنج مقاوم به علفکش تولید شده است. با این سیستم، دو جهش نقطه ای در ژن استولاکتات سنتاز برنج برای تولید لاینهای برنج مقاوم به علفکش ایجاد شده است.
گیاهان ویرایش شده نسل اول از نظر شکل ظاهری طبیعی بوده و تفاوتی با گیاهان کنترل نداشتند درحالیکه مقاومت بالایی به علف کش بیسپیریباک سدیم نشان دادند - لی و همکاران، . - 2016 بلایت باکتریایی که توسط زانتوموناس ارایزا ایجاد میشود یکی از شایعترین بیماریهای گیاه برنج میباشد. با استفاده از TALENها مقاومت به این بیماری در برنج ایجاد شده است. برای بیماریزایی این باکتری بیان ژن ترانسپورتر قند - Os11N3 - که ژن حساسیت شناخته میشود، ضروری است.
