بخشی از مقاله
چکیده:
Anthemideae یکی از زیر خانوادههاي مهم متعلق به خانوادهي Asteraceae میباشد. در این زیرخانواه 5 جنس با اهمیت وجود دارند که عبارتنداز: Achillea.sp یا بومادران، Anthemis.sp یا بابونه، Tanacetum.sp یا مخلصه، Artemisia.sp یا درمنه، Santolina.sp که غالبا به عنوان گیاهان دارویی مهم در پزشکی مطرح میباشند. این گیاهان داراي ترکیبات فعال از جمله آنتی اکسیدانها میباشند که آنان را از اثرات مضر گونههاي واکنشگر اکسیژنی - ROS - نجات میدهند. در این تحقیق،4 ژن مهم دخیل در مسیر سنتز آنتی اکسیدانها در برخی از جنسهاي مهم این زیر خانواده بررسی شدند.
یکی از این ژنها aox2 میباشد که کد کنندهي یکی از زیرواحدهاي آنزیم Alternative oxidase یا AOX است و سه ژن دیگر pal1 - ، pal2 و - pal3 مربوط به آنزیم phenyl alanin ammonia lyase یا PAL میباشند. در این مطالعه، ابتدا براساس همردیف سازي چندتایی توالیهاي جستجو شده در پایگاه دادههاي Gene bank، آغازگرهاي اختصاصی با استفاده از نرم افزارهاي مناسب طراحی و سپس تکثیر آنها در 5 جنس مذکور بررسی شد.
پس از انجام واکنش pcr مشخص شد که سه آغازگر مربوط به ژنهاي aox2، pal1 و pal2 باند موردنظر ما را به طور واضح تکثیر نمودند اما آغازگر مربوط به ژن pal3 تکثیري در جنسهاي مدنظر ما نداشت که احتمالا به دلیل عدم حضور این زیرواحد در جنس هاي مدنظر ما میباشد. aox2 در تمام جنس هاي مدنظر ما تکثیر شد و این به دلیل حفاظت شدگی بالاي این ژن در جنسهاي مدنظر ما بود. هم چنین جنس هاي Achillea.sp ، chrysanthemu.sp و Santolina.sp از نظر ژن pal1 قرابت زیادي با یکدیگر نشان دادند درحالیکه جنسهاي Artemisia.sp ، chrysanthemum.sp ،Anthemis.sp ، Achillea.sp از نظر ژن pal2 با یکدیگر شباهت داشتند.
مقدمه :
تیرهي کاسنی1 در حدود 950 جنس و 20000 گونه دارد. براي این خانواده 19 زیرخانواده در نظر میگیرند که در این میان زیرخانواده Anthemideae یکی از زیرخانوادههاي مهم متعلق به این خانواده میباشد که در این زیرخانواده 109 جنس و 1740 گونهي گیاهی وجود دارد. بیش از %50 این گونهها در پنج جنس اصلی زیر خلاصه میشوند: Achillea.sp یا بومادران 115 - گونه - ، Anthemis.sp - 2 یا بابونه 210 - گونه - ، Tanacetum.sp - 3 یا مخلصه 150 - گونه - ، Artemisia.sp - 4 یا درمنه 390 - گونه - ، 130 - Serphidum.sp - 5 گونه - بسیاري از جنسها و گونههاي متعلق به این طایفه از جنبههاي مختلف حائز اهمیت میباشند. تعدادي از آنها به عنوان گلهاي زینتی و شاخهبریده مورد استفاده قرار میگیرند. ازآن جمله میتوان به داوودي - - chrysanthemum.sp، بومادران - - Achillea.sp، درمنه - - Artemisia.sp، بابونه - - Matricaria,Anthemis.sp و Santolina.sp اشاره نمود.
اکثر آنها به عنوان گونههاي دارویی و معطر در تولید اسانسهاي روغنی در پزشکی و داروسازي حائز اهمیت میباشند. بومادران، درمنه، بابونه، Santolina.sp و داوودي ازجمله مهمترین جنسهایی هستند که داراي مواد معطره و اسانسهاي روغنی مؤثر میباشند و گونههاي مختلف آنها کاربردهاي قابل توجهی در پزشکی و داروسازي دارند. این گیاهان داراي ترکیبات فعالی از جمله آنتی اکسیدانها میباشند که آنان را از اثرات مضر گونههاي واکنشگر اکسیژنی - ROS - نجات میدهند.
گونه هاي واکنشگر اکسیژنی - ROS - 2 مهمترین رادیکالهاي آزاد در سیستم هاي بیولوژیکی هستند که به عنوان محصولات فرعی طبیعی و غیرقابل اجتناب در طی متابولیسم هوازي تشکیل میشوند [3] - جدول. - 1 گونههاي واکنشگر اکسیژنی ROS ترکیبات ناخوشایند زندگی هوازي شدند. در مقایسه با اکسیژن، این ترکیبات بسیار واکنشگر و سمی هستند و میتوانند موجب آسیبهاي اکسیداتیو به سلولها شوند. بنابراین تکامل همهي موجودات هوازي بستگی به گسترش مکانیسمهاي کارآمد براي تخریب ROS ها دارد .[6] در دنیایی که گیاهان در آن زندگی میکنند به طور متناوب ممکن است در معرض تنشهاي غیرزنده قرار گیرند که باعث راه اندازي یکسري از تغییرات مولکولی، بیوشیمیایی و مورفولوژیکی در گیاهان میشود.
نتیجهي مستقیم این اثرات اولیه، افزایش و تجمع گونههاي فعال واکنشگرهاي اکسیژنی - ROS - است که در غلظت بالا براي گیاه مضرند. ROS ها میتوانند با لیپیدها، پروتئینها، کربوهیدراتها و یا نوکلئیک اسیدها واکنش داده و باعث آسیبهاي اکسیداتیو به این ماکرومولکولها شوند و در نهایت ممکن است منجربه مرگ سلولی گردند3]،2،. [4 به طورکلی اثرات مضر ROS در سلول ها اغلب به صورت زیر است:
1 - آسیب به - 2 DNA اکسیداسیون اسیدهاي چرب غیراشباع در لیپیدها - پراکسیداسیون لیپیدها - - 3 اکسیداسیون آمینواسیدها در پروتئینها - 4 غیرفعال شدن آنزیمهاي ویژه به واسطهي غیرفعال کردن کوفاکتورهاي آنها مکان اصلی تولید ROS در گیاهان شامل میتوکندريها، کلروپلاستها، میکروباديها - پراکسیزومها و گلیاکسیزومها - ، آپوپلاست و شبکهي آندوپلاسمی میباشد 3]،.[2 در طی روز کلروپلاستها و پراکسیزومها و در طی شب میتوکندريها بیشترین تولید ROS را دارند .[5] با همهي این توصیفات گیاهان عالی میتوانند در نوسانات محیطی زنده بمانند زیرا مسیرهاي متابولیکی مختلفی در آنها توسعه پیدا کردهاند که توانایی مقابله با شرایط افزایش ROS را به آنها میدهند.
[4] در آرابیدوپسیس یک شبکهي ژنی با بیش از 150 ژن براي سمزدایی ROS حضور دارد .[6] ژنهاي متعددي از گیاهان که براي آنزیمهاي آنتیاکسیدانی کد میشوند، کلون و مشخص شدهاند و در ایجاد لاینهاي تراریخته مورد استفاده قرار گرفتهاند .[8] به طور کلی ترکیبات آنتیاکسیدانی مهم را میتوان در دو گروه خلاصه کرد: آنتیاکسیدانهاي آنزیمی و آنتیاکسیدانهاي غیرآنزیمی فلاونوئیدها یکی از ترکیبات آنتی اکسیدانی غیرآنزیمی مهم میباشند که داراي فعالیتهاي آنتیاکسیدانی در برابر ترکیبات اکسید شونده هستند.
این مواد به دستهي وسیعی از ترکیبات آلی یعنی فنولیکها تعلق دارند. فلاونوئیدها به طور وسیعی در گیاهان یافت شده و به طور معمول در برگها، بخشهاي گل و دانه و دانههاي گرده تولید میشوند. فلاونوئیدها شامل flavones، isoflavones و آنتوسیانیدینها میباشند و داراي یک اسکلت پایهي - C6-C3-C6 diphenylpropans - با سطوح متفاوت اکسیداسیون حلقهي pyran مرکزي هستند.[5] یکی از آنزیم هاي کلیدي در مسیر سنتز این گروه از آنتیاکسیدانها، آنزیم 3PAL است که منجر به آزاد شدن گروه آمینو از فنیلآلانین و تشکیل یک پیوند دوگانهي کربن-کربن میشود و در نتیجه تولید trans-cinnamic acid میکند. در این مسیر ترکیب دیگري به نام 4-coumaryol-CoA تولید می شود که4-coumaryol-CoA میتواند همچنین وارد مسیر دیگري شده و منجر به تولید ترکیبات لیگنینی شود.[5]
یکی دبگر از ترکیبات مهم که به عنوان یک آنزبم قوي در تخربب گونههاي واکنشگر اکسیژنی عمل میکند آنزیم 4AOX است که در مسیر زنجیرهي انتقال الکترون در میتوکندري فعالیت میکند. این آنزیم داراي چند زیرواحد میباشد که چندین ژن در کد کردن این زیرواحدها دخیلاند. در این پروژه سعی داریم با استفاده از روشهاي gene prediction و جستجوي شباهتها بین توالیهاي مدنظر ما با توالیهاي شناخته شده در پایگاه دادهها Gene bank، ژنهاي aox2 و نیز ژنهاي pal1، pal2 و pal3 - زیرواحدهاي ژن - pal را در گروهی از جنسهاي زیرخانوادهي Amthemideae ردیابی کنیم. با جستجوهایی که صورت گرفت مشخص شد که این ژنهاي آنتیاکسیدانتی در جنسهاي مدنظر ما قبلاً مورد مطالعه قرار نگرفته اند.در این تحقیق با طراحی آغازگرها از نواحی حفاظت شده با استفاده از روشهاي بیوانفورماتیکی، ژنهاي - pal1, pal2, pal3 - pal و همچنین ژن aox2 درگیاهان مدل یا در گیاهان نزدیک به جنس هاي مورد مطالعه را ردیابی نمودیم.
مواد و روش ها:
به منظور ردیابی ژن هاي aox2 و pal1، pal2 ،pal3 ابتدا لازم بودکه از توالی این ژن ها طراحی آغازگر صورت گیرد. از آنجا که توالی ژن هاي مربوطه در جنس هاي مدنظر ما هنوز ناشناخته بودند لذا طراحی آغازگر از گیاه مدل آرابیدوپسیس آغاز گشت. به این منظور ابتدا توالی هاي مربوطه در پایگاه داده هاي Gene bank جستجو شد. سپس با استفاده از نرم افزار MEGA ver 4.0 همردیف سازي چندتایی براي توالی هاي موردنظر صورت گرفت و پس از آن بر اساس ناحیه هاي حفاظت شده طراحی آغازگر صورت گرفت. طراحی آغازگر ها با استفاده از نرم افزار OLIGO ver 5.0 انجام شد . سپس توالی آغازگرهاي طراحی شده به شرکت Bioneer فرستاده شد و پس از مدت 15 روز آغلزگرهاي سنتز شده به دست ما رسید.
نمونه هاي برگی از جنس هاي chrysanthemum.sp، Achillea.sp، Anthemis.sp، Tanacetum.sp، Artemisia.sp و santolina.sp با استفاده از روش موري و تامپسون صورت گرفت. کیفیت وکمیت DNA استخراج شده به وسیله الکتروفورز ژل آگارز % 0/7تعیین گردید. واکنش PCR در حجم 15 میکرولیتر شامل1/5 میکرولیتر بافر 10 PCR برابر غلظت، 2 میلی مولار کلرید منیزیم، یک واحداز آنزیم Taq DNA پلیمراز، 0/2 میکرو مولار dNTPs، 0/3 میکرو مولار از هر آغازگر،20 نانوگرم DNA انجام شد. تکثیر در دستگاه ترموسایکلر شرکت Biorad انجام شد. محصول PCR به همرا نشانگر اندازه - Fermentase Life Science Co. - 100bp به منظور تخمین اندازهي قطعات بر روي ژل آگارز 1.2% در بافر TBE الکتروفورز شد.
نتایج و بحث:
طراحی آغازگرها بر اساس نواحی حفاظت شده انجام شد. براي جستجوي نواحی حفاظت شده ابتدا دومینهاي پروتئینی در مورد هر ژن در سایت Expassy جستجو شد. سپس همردیفسازي چندتایی در توالیهاي نوکلئوتیدي مربوط به ناحیهي دومین انجام شد و پس از جستجو، ناحیهاي با بهترین حفاظت شدگی پیدا و طراحی آغازگر صورت گرفت. ما در طراحی آغازگرها سعی نمودیم طراحی را از درون اگزونها انجام دهیم.
آنچه در هنگام طراحی آغازگرها مشاهده شد، نشان داد که حفاظت شدگی توالیها در ناحیهي دومین در مورد ژنهاي مختلف متفاوت بود، به طوري که این حفاظت شدگی در مورد ژن aox2 بیشتر از ژنهاي pal بود و در بین ژنهاي pal نیز ژن pal2 بیشتر از ژن pal1 و ژن pal1 نیز بیش از ژن pal3 بود که نتایج بعدي نیز، این مشاهدات را اثبات کرد. پس از انجام فرآیند pcr با استفاده از آغازگرهاي اختصاصی طراحی شده، تکثیر صورت گرفت. نتایج بر روي ژل آگاروز TBE%1/2 نشان داد که در مورد ژن aox2، همه جنسهاي Artemisia.sp، chrysanthemum.sp، Achillea.sp، Anthemis.sp، Tanacetum.sp باند مورد نظر ما را تکثیر نمودند.
