بخشی از مقاله
روش هاي انتقال ژن در مهندسی ژنتیک و تولید گیاهان تراریخته
چکیده :
مهندسی ژنتیک یا انتقال ژن فرآیــــندي است که طی آن قطعه مشخصی از DNA خارجـــی که حاوي ژن جــــــدید یا ترکیب جدیدي از ژن ها میباشد ، با استفاده از فنون آزمایشــگاهی بطور مصنوعی وارد ژنوم یک ارگا نــــیسم میگردد .
گونه دریافت کننده ژن جدید را گونه ترانسژنیک یا تراریخته می نامند. مهمترین انواع روشهاي انتفال مستقیم ژن عبارتـند از تفنگ ژنی یا بـــیولیستیک ، تکنیک لیپوزوم ، ا لکترو پوریشن ،ریز تزریقی ، درشــت تزریقـــی وروش شیمیایی شامــل
اســـــتفاده از پلی اتیل گلیکـــول در انتقال میباشد و از مهمترین روشهاي غیر مســـتقیم روش اگروباکتریوم و ا نتقال با
ویــروس اشاره نمود، اگر بتوان فقط یک سلول گیاه را تغییر داد، میتوان با کنترل رشد و تمایزآن سلول درآزمایشگاه، یک
گیاه بالغ با خصوصیات جدید تولید کرد. وکتـــوري کـــه بــراي انتقال ژنها به درون سلولهاي گیاهی بهکار میرود، پلازمیدي است که از باکتري ( Agrobacterium tumefaciens) که باکتري خاکزي و گرم منفی استخراج میشود.
در طبیعت، این باکتري گیاهان را آلوده میکند و تومورهایی را بهنام گالــهاي تاجی در آنها ایجـــاد میکند. تفنگ ژنی قسمتی از روشی است که به آن( ( Biolistic گویند. در این روش تحت شرایط خاص،قطعاتی از DNA یا RNA با دنباله
چسبناك را وارداتم هاي فلزاتی نظیر طلا یا تنگستن می نمایند.کمپلکســی از ذرات حاوي DNA را در خلا شتاب داده و با شتاب بسمت بافت هدف شـــلیک می کنند.
گیاهانی که به این طریق با برخورداري ازویژگی هایی مانند ارزش غذایی بالاتر ، افزایش خاصیت انــــبارداري ، مقاومـــــت به آفات و ویروس ها و..... بدست می آید به نام تراریخته معروفند. تاکنون آثار زیان آور و ابعاد مــــخاطره آمیز محــــــصولات تراریخته و بیوتکنولوژي بطور قطعی از نظر علــمی به اثبــــــات نرسیده و دانشمندان این رشته نمی توانند و نــباید آثار منفی احتمالی این محصولات را بر محیط زیست و سلامت انسان نادیده بگیرند .
کلمات کلیدي : مهندسی ژنتیک – اگروباکتریوم – تفنگ ژنی – گیاهان تراریخته
مقد مه :
بیوتکنولوژي و مهندسی ژنتیک دانش جدیدي است که نخستین دستاوردهاي آن در هاله اي از بیم و امید ارزیابی می شود کمتر دانشی به اندازه مهندسی ژنتیک با ساختار اصلی و قانونمند سامانه هستی درگیر شده است. گیاهان زراعی تراریخته، گیاهانی شبیه به همتاي طبیعی خود هستند، با این تفاوت که با استفاده از دستکاري ژنتیکی، در یک یا چند صفت ویژه نسبت به نوع طبیعی خود برتري دارند. کشت این گیاهان منافعی را براي تولیدکنندگان (کشاورزان) و مصرفکنندگان در بردارد؛ بهعنوان مثال، علاوه بر اینکه محصول بیشتري عاید تولیدکننده می شود، مواد شیمیایی کمتري (آفت کش یا علف کش) نیز مصرف می شوند. تاکنون محصولات تراریخته در گیاهان مختلفی در جهان تولید شدهاند که از آنجمله می توان
1
همایش منطقه اي غذا و بیوتکنولوژي، دانشگاه آزاد اسلامی واحد کرمانشاه، 14-13 اسفند 1388
مواردزیررانام برد:سویا، برنج، ذرت، جو، پنبه، سیبزمینی، کلزا، سیبزمینی شیرین، گوجهفرنگی، کدو، چغندرقند، پاپایا، سیب، انبه، موز، آناناس و نارگیل.
مهندسی ژنتیک :
مهندسی ژنتیک یا انتقال ژن فرآیندي است که طی آن قطعه مشخصی از DNA خارجی که حاوي ژن جدید یا ترکیب جدیدي از ژن ها میباشد ، با استفاده از فنون آزمایشگاهی بطور مصنوعی وارد ژنوم یک ارگا نیسم میگردد . گونه دریافت کننده ژن جدید را گونه ترانسژنیک یا تراریخته می نامند . با کمک تکنیکهاي مهندسی ژنتیک میتوان ژنهاي مطلوب و مورد نظر را از هر منبع ژرم پلاسمی اعم از گیاه ، جانور و حتی میکروارگانیســـم ها به گیاه زراعی منتقل نمود . روش هاي انـــتقال ژن به دو دسته مستقیــم وغیر مستقیم طبقه بندي میشوند . مهمترین انواع روشهاي انتفال مستقیم ژن عبارتند از تفنگ ژنی یا بیولیستیک ، تکنیک لیپوزوم ، ا لکترو پوریشن ،ریز تزریقی ، درشت تزریقی وروش شیمیایی شامل استفاده از پلی اتیل گلیکول در انتقال میباشد و از مهمترین روشهاي غیر مستقیم روش اگروباکتریوم و ا نتقال با ویروس اشاره نمود . با توجه به اهمیت روش تفنگ ژنی وا گروباکتریوم این دو روش را بررسی خواهیم کرد :
روش اگروباکتریوم :
یکی از خاصیتهاي مهم گیاهان این است که میتوان در آزمایشگاه، از یک سلــــول گیاه، یک گیاه بالغ پدید آورد. این خاصیــت را ” باززایی“میگویند. بنابراین، اگر بتــوان فقط یک سلول گیاه را تغییر داد، میتوان با کنترل رشد و تمایز آن سلول در آزمایشگاه، یک گیاه بالغ با خصوصیات جدید تولید کرد.
وکـــــتوري که براي انـــــــتقال ژنهـــــا به درون سلـــــولهاي گیـــــاهی بهکار میرود، پلازمــــیدي اســـت که از باکتري Agrobacterium tumefaciens) )که باکتري خاکزي و گرم منفی است استخراج میشود. در طبیعت، این باکـتري گیاهان را آلوده میکند و تومورهایی را بهنام گالهاي تاجی در آنها ایجاد میکـــند. پلازمیدي که مســؤول ایجاد تومور است، ”پلازمید “Ti نامیده میشود. پلازمید Ti قسمتی از DNA خود را ، که t-DNA نام دارد که بر روي پلازمید Ti
بین دو توالی تکــراري کوتاه به نامهاي RB و LB قرار گرفته و شامل دو د سته ژن است ، به درون DNA
کروموزومی سلول گیاه میزبان وارد میکــــند. براي اهداف مهندسی ژنتیک، پژوهشگران از پلازمیدي استفاده میکنند که خاصیت بیماريزایی آن ازبین رفته است.
ژنی را که میخواهند وارد گیاه کنند، درون پلازمید Ti قرار میدهند. پلازمید نوترکیبی را که به این ترتیب ساخته میشود میتوان به دو صورت بهکار گرفت:
(1) میتوان آن را به باکتـــري آگرو باکـــتریوم بازگرداند و بعد با این باکتري، گیاهی را که در محیط کشت قرار دارد، آلوده کرد.
(2) میتوان آن را مســـــتقیما به درون سلولهاي گیاه وارد کرد. به این ترتیب پلازمید به درون DNA کروموزومی وارد میشود. با بهرهگیري از خاصیت باززایی سلولهایی که پلازمید را دریافت کردهاند، میتوان گیاهان بالغی ســاخت که نه تنها
2
همایش منطقه اي غذا و بیوتکنولوژي، دانشگاه آزاد اسلامی واحد کرمانشاه، 14-13 اسفند 1388
حاوي ژن مورد نظر باشند، بلکه بتوانند آن را به نسلهاي بعد نیز انتقال دهند. مزایاي روش اگروباکـــتریوم شامل پایـــداري ژن انتقال یافته و بالا بودن کارایی ا نتقال ژن و انتقال قطعات بزرگ DNA است مشکلی که در راه استفاده از آگروباکتریوم وجود دارد این است که فقط گیاهان دولپه با این باکتري آلوده میشوند. گیاهان تک لپه، مثل ذرت و گندم که از نظر اقتصادي حائز اهمیتاند، نمیتوانند با آگروباکــتریوم آلوده شوند. مهندسان ژنتیک براي وارد کردن DNA به این سلولها از روشهاي جدیدتري بهره میگیرند که یکی از آنها، استفاده از تفنگ ژنی است.
روش تفنگ( ( Biolistic
تفنگ ژنی در سال 1979 توسط John Stanford در دانشگاه Cornell ساخته شد و روش جــدیدي براي آسانتر نمودن انتقال ژن به سلولهاي گیاهی که آن زمان از ویروس ها و یا اگروباکتریوم ( پلازمید (Ti ا ستفاده می شد، مطرح ساخت.امروزه تفنگ ژنی موارد استفاده متعددي دارد، این وسیله انتقال ژن به باکتري ها، مخمرها، سلولهاي پستانداران و مخــصوصا سلولهایی که انتقال ژن به آنها غیر ممکن بود را امکان پذیر ساخت. این وسیله بصورت اختـــــصاصی براي انتقال ژن به کلروپلاسـت بسیار مهم است، زیرا هیچ باکتري یا ویروسی شناخته نشده است تا بتواند کلروپلاست را آلوده نماید.
بنابراین براي انتقال ژن خارجی به کلروپلاســـت این روش بسیار مفید به نظر می رسد.
مکانیسم عمل تفنگ ژنی:
تفنگ ژنی قسمتی از روشی است که به آن ( Biolistic )گویند. این روش Bioballistic) )نیز گفته می شود. در این روش تحت شرایط خاص، قطعاتی از DNA یا RNA با دنباله چسبناك را وارد اتم هاي فلزاتی نظیر طلا یا تنگستن می نمایند.
کمپلکسی از ذرات حاوي DNA را در خلا شتــــاب داده و با شتاب بسمت بافت هدف شلیک می کنند. براي ایجاد DNA
پوشش دار، DNA را درحلالی که حاوي ذرات فلزي است قرار می دهــــند ، عوامــــل ژنــــتیکی که به این صـورت تولید می شوند، داخل فشنگ هایی قرار می گیرند، بعد از شلیک، یک صفحه سوراخدار از حرکت فشنگ ها جلوگیري می کند اما به ذرات
طلا اجازه عبور می دهد تا به بافت مورد نظر اصابت نماید. سلولها عموما تمایل به بازجذب ژنهایی دارند که داراي نشانه
خاصی(مارکر) باشند( در سلولهاي گیاهی بصورت عمومی از GUS استفاده می کــــنند)، سپس در محیط کشت ژنها تکثیر کرده و ممکن است، کلون شوند. بیشترین کاربرد متد Biolistic افزودن ژنــــهاي به گیاهان است که بتوانند در برابر
قارچهاکشـــها و حشرات کشها مقاومت نمایند. براي شتاب دادن به ذرات طلا روشـــهاي متعددي بکار می رود که
عبارتند از : مرکز گرایی ، نیروهاي مغناطیسی و الکتریکی، تفنگهاي افشانه اي یا واکـــسنی و یا دستگاههایی که اساس
شتابدهی آنها، امواج شوکی هستند، همانند استفاده از تخلیه الکــتریکی .1992 روشهاي عملی متعددي که کاملا کنترل شده هستند، براي حداکثر کـارآیی انتقال ژن بکار گرفته شده اند. میزان پاسخ روش به عواملی مانند تعداد ذرات DNA پوشش دار، دما، تعداد سلولهاي بافت هدف، توانایی جذب DNA توسط سلول هدف و همــچنین به نوع تفنگ مورد استفاده وابسته است.
نحوه عملکرد تفـــنگ ژنی که با گازهلـیوم کارمی کند و ذرات پوشش دار DNA را بسمت بافت هدف شلیک می کند. از موارد بسیار مهمی که باید در استفاده از تفنگ ژنی در نظر گرفت، انتخاب اندازه ذرات پرتابی و سرعت شلیک آنها بسمت بافتها است. بعنوان مثال بافتهاي نرم را نباید در معرض بمباران ذرات پوشش دار با سرعت بالا قرار داد. این فرآیند تنظیمی کاملا وابسته به جــنس ذرات فلزي حاوي مولکولهاي DNA و نوع سلولهایی که براي انتقال ژن در نظر گرفته شده اند، وابسته است.
