بخشی از مقاله
چکیده
آقات پروانهاي چغندر قند باعث خسارت شدید در اآثر نواحی تحت آشت دنیا به خصوص در ایران میشوند. به دلیل محدود بودن منابع ژنتیکی مقاومت به حشرات آفت و پلی ژنیک بودن این صفت، بهبود آن از طریق اصلاح آلاسیک آند و مشکل است. انتقال ژنهاي مختلف از جمله ژن هاي Bt میتواند یک راهبرد مکمل و جایگزین براي مبارزه با آفات چغندرقند باشد. دو لاین دیپلوئید چغندر قند در تراریختی به آمک آگروباآتریوم سویهGV3101 دربردارنده پلاسمید pBI35Scry حاوي ژن cry1Ab تحت آنترل پروموتر CaMV 35S و ژن گزینشگر nptII استفاده شد. برگ حاوي پابه جوانه بعنوان ریزنمونه در تراریختی بکار رفت.
جوانههاي تراریخت احتمالی در محیط آشت حاوي غلظتهاي مختلف آانامایسین پس از60 روز دوره گزینش غربال شدند. واآنش زنجیرهاي پلیمراز حضور ژن هدف را در بیش از50 درصد گیاهچههاي مقاوم به آانامایسین نشان داد. تجزیه لکهگذاري نقطهاي، درج ژن هدف را در این گیاهان تایید آرد. نتایج حاصله از آزمایش زیست سنجی، ظهور ژن و مقاومت گیاهان تراریخته بر علیه آرم برگخوار پرودنیا - Spodoptera littoralis - را نشان داد. براي بررسی وراثت پذیري ژن انتقالی و پایداري مقاومت در نسل هاي بعدي، گیاهان نسل صفر علاوه بر خود گشنی، با یک لاین نرعقیم تلاقی داده شدند.
کلمات کلیدي: آگروباآتریوم تومه فاسینس ، چغندرقند، ژن cry1Ab، تراریختی، آفات پروانهاي
مقدمه چغندرقند از مهمترین گیاهان صنعتی در دنیا و ایران بوده و با وسعت آشت 8 میلیون هکتار در حدود 35 درصدشکر جهان بوسیله آن تولید میشود - . - 11 آفات حشراي حدود 14 درصد آل محصولات آشاورزي جهان را از بین میبرند - . - 2 آفات پروانهاي1 از جمله آفات مهم هستند آه در اغلب مزارع چغندر وجود داشته و خسارات زیادي را وارد میآنند . - 1 - به دلیل وضعیت زیستی خاص چغندرقند از جمله دو ساله بودن، آلوگامی، خودناسازگاري و همچنین به دلیل محدود بودن منابع مقاومت و تنوع ژنتیکی در چغندرقند، بهبود بسیاري از صفات زراعی از جمله مقاومت به آفات حشرهاي از طریق اصلاح آلاسیک موفقیت آمیز نبوده و یا مشکل است - . - 4
استفاده از روشهاي نوین مهندسی ژنتیک و انتقال ژنهاي مسئول ایجاد مقاومت به حشرات آفت در چغندرقند میتواند به عنوان راهکاري براي برون رفت از این مشکل مورد ارزیابی قرار گیرد. ژنهاي مختلفی براي ایجاد گیاهان چغندرقند مقاوم به آفات شامل ژنهاي رمزآننده اسموتین، پلیپپتید سکروپین تغییریافته MB39 و پلی پپتید آلفا تیونین برگ جو - 10 - ، ژن سازنده سیتوآینین باآتریایی موسوم به - 9 - ipt، بازدارندههاي پروتئینازي - 11 - براي مقاومت به مگس ریشه، ژن هاي cry1Ab و cry1C براي مقاومت به آرم آلم - 6 - بکار رفته است. در این تحقیق، با استفاده از یک روش بهینه شده و آارا و با دخالت دادن عوامل موثر در انتقال پایدار - 8 - T-DNA، ژن cry1Ab بواسطه آگروباگتریوم به گیاه چغندرقند منتقل شده است.
مواد و روش ها مواد گیاهی
در این تحقیق از دو رقم منوژرم H و مولتی ژرم S چغندرقند جهت تراریختی استفاده شد. محیط آشت و تهیه جوانههای کشت بافت جهت تلقیح به روش تغییر یافته نوروزي و همکاران - 7 - و هیسانو و همکاران - 3 - انجام گرفت.به منظور ساخت سازه حاوي ژن cry1Ab ابتدا پلاسمید pCIB4421 توسط آنزیم هاي BamHI/EcoRI برش داده شد تا قطعهاي به طول 2162 bp - شامل ژن cry1Ab، قطعه مربوط به Intron9 ژن PEPC ذرت و توالی پایان دهنده - 35S بدست آید. قطعه مزبور در پلاسمید pBI121 به جایگاه BamHI/EcoRI - با حذف ژن - gus متصل شد و بدین ترتیب سازه جدید pBI35Scry حاوي ژن cry1Ab تحت آنترل پروموتر CaMV 35S، توالی پایان دهنده 35S و ژن گزینشگر nptII ساخته شد.
تلقیح ریز نمونه با آگروباآتریوم، گزینش و باززایی گیاهچهها
تلقیح ریز نمونه ها بوسیله آگروباآتریوم تومهفاسینس سویه GV3101 حامل پلاسمید pBI35Scry ، گزینش و باززایی گیاهچهها به روش تغییر یافته نوروزی و همکاران - 7 - و هیسانو و همکاران انجام گرفت - . - 3
تجزیه PCR و لکه گذاري نقطه اي2
دي.ان.اي ژنومی از برگ گیاهچههاي گزینش شده به روش دلاپورتا استخراج شد - - 1 و به منظور تایید حضور تراژن در گیاهچههاي تراریخته احتمالی، تجزیه PCR با آغازگرهاي اختصاصی ژن cry1Ab به روش استاندارد انجام شد. تجزیه لکهگذاري نقطهاي طبق دستورالعمل Dig DNA Labeling and Detection Kit - شرآت Roche، آلمان - انجام شد.
زیست سنجی گیاهان تراریخته نسل T0
زیست سنجی گیاهان تراریخته با لارو سن اول آرم برگخوار پرودنیا3 انجام گرفت. بر روي هر برگ جوان تعداد هفت لارو سن اول در سه تکرار در داخل پتري دیش قرار گرفت. میزان مرگ و میر و متوسط وزن لاروها طی3 و 7 روز پس از آلودگی یادداشت برداري شد.
نتایج و بحث باززایی و گزینش گیاهچه هاي مقاوم به آانامایسین
بر اساس نتایج حاصله از تلقیح ریز نمونه برگ حامل پایه جوانه تحت شرایط بهینه شده تراریختی، رقم مولتی ژرم S قدرت باززایی و در صد تراریختی بیشتري نسبت به رقم منوژرم H نشان داد. استفاده از ترآیب هورمونی - 1 mg/l - BA و - 1 mg/l - NAA در محیط آشت توام و گزینش باعث شیشهاي شدن بیشتر جوانه ها شد ولی در حضور ترآیب هورمونی - 0/25 mg/l - BA و - 0/1 mg/l - IBA به خصوص در مرحله گزینش، باززایی جوانهها به بهترین نحو صورت گرفت. میزان باززایی گیاهچههاي مقاوم به عامل انتخابی بین 40-80 درصد متغیر بود - دادهها نشان داده نشدند - .
تجزیه مولکولی گیاهان باززایی شده نسل T0
تجزیه PCR حضور ژن cry1Ab را در بیش از50 درصد گیاهچههاي مقاوم به آانامایسین تایید آرد - شکل - 1–A گیاهان تراریخته احتمالی باندي هم اندازه آنترل مثبت - 1190 pb - نشان دادند. تجزیه لکهگذاري نقطهاي براي اآثر گیاهان PCR+ نشان داد آه ژن cry1Ab در ژنوم گیاهان مورد بررسی درج شده است - شکل - 1– B و میتوان گفت آه این گیاهان حداقل یک نسخه از ژن هدف را دریافت آردهاند.
تجزیه عملکردي ژن cry1Ab درگیاهان تراریخته
نتایج حاصله از زیست سنجی چند لاین تراریخته در جدول یک آمده است. مقاومت این لاین هاي تراریخته بین 50 تا 71 درصد متغیر است و متوسط وزن لاروها، 3 و7 روز پس از آلودگی در گیاهان تراریخته در مقایسه با گیاه شاهد - غیرتراریخته - نشانگر عدم رشد و یا رشد بسیار آم لارو ها در اثر تغدیه از گیاهان Bt می باشد - شکل . - 1-C به منظور تولید نسلهاي بعدي و بررسی وراثتپذیري و مقاومت پایدار، گیاهان تراریخته ضمن خودگرده افشانی، با یک لاین نر عقیم تلاقی داده شدند. با توجه به اهمیت این گیاه، خسارت قابل توجه آفات پروانه اي به خصوص در آشور و آافی نبودن منابع مقاومت در ژرم پلاسم، به نظر میرسد تولید چغندرقند Bt راهکار مناسبی براي آنترل آفات آن و بهبود مدیریت تلفیقی آفات باشد. سپاسگزاري: از موسسه تحقیقات اصلاح و تهیه بذر چغندرقند و موسسه تحقیقات بیوتکنولوژي آشاورزي آرج به خاطر حمایت مالی و در اختیارگذاشتن امکانات آزمایشگاهی آمال تشکر و قدردانی میشود.
