بخشی از مقاله
خلاصه
در مطالعه حاضر، cDNA فاکتور 9 انعقادي از سلول هاي کبدي انسان تهیه ودر وکتور pBC1 به منظور ترشح در شیر بز تراریخته کلون گردید. وکتور نوترکیب حاصل به سلول هاي فیبروبلاست جنینی و پس از تایید به تخمک بز انتقال یافت. کلیه مراحل با استفاده از روش هاي مختلف مولکولی تأیید شدند. تخمک هاي باز سازي شده تا مرحله 8 سلولی کشت داده شده و سپس به اویداکت حیوان پذیرنده منتقل شدند. بارداري ها یک ماه پس از انتقال جنین توسط اولتراسونوگرافی تأیید شدند. از 12 انتقال جنین صورت گرفته، 2 مورد بارداري تأیید شد.یک مورد تا مرحله ترم پیش رفته و 2 بزغاله سالم متولد شد. در انتها با استفاده از روشهاي مولکولی حیوانات متولد شده مورد بررسی و تراریختگی آنها تأیید گردید.
مقدمه
طی دودهه گذشته حیوانات تراریخته - Transgene - جایگاه ویژه اي درروند تحقیقات علوم زیستی کسب کرده اند. تولید حیوان ترنسژنیک کاربردهاي متعددي دارد از جمله تولید حیوانات با کارایی بهتر 1 - و - 2،حیوانات به عنوان مدل هایی براي مطالعه بیماري هاي انسان 3 - و - 4، حیواناتی براي تولید پروتئین هاي دارویی مورد نظر - 5-8 - ، حیوانات براي تولید ارگان هایی براي پیوند - زنوترنسپلنت9 - - 1و - 10 و حیواناتی براي تنظیم و بیان ژن11 - و. - 12 کاربردهاي صحیح انتقال ژن در حیوانات مزرعه موجب بهبود کیفیت و مقدار محصول، مقاومت به بیماري، تولید پروتئین هاي با ارزش در غدد شیري یا ارگان هاي دیگر، تغییرات ژنتیکی خوك ها براي تولید زنوترنسپلنت و تولید مدل هاي حیوانی جدید براي زمانی که جوندگان براي مطالعه مشکل مورد نظر، مفید یا قابل استفاده نمی باشند می شود . - 13 -
در این تحقیق در راستاي تولید بز تراریخته، ژن فاکتور IX انعقادي انسان جهت انتقال انتخاب گردید. نقص در سنتز فاکتور IX موجب بیماري هموفیلی B یا کریسمس می شود . - 14 - این بیماري یک اختلال وابسته به x است که در یک مورد از 30 هزار مرد اتفاق می افتد. .بیمارانی که هموفیلی B دارند با فاکتور IX که از پلاسماي ذخیره شدة افراد طبیعی بدست می آید درمان می شوند. این آماده سازي فاکتور IXممکن است تب آورباشد یا با عوامل پاتولوژیک یا ویروسی آلوده شود. بنابراین نیاز است که وسیله اي براي آماده سازي فاکتور IX خالص که نیاز به استخراج از پلاسماي انسان نداشته باشد فراهم گردد. از اینرو تولید انبوه این محصول بوسیله یک کارخانه طبیعی مانند غدد شیري حیوانات مورد توجه قرار گرفت. بدین منظور تولید فاکتور 9انعقادي انسانی در شیر بز تراریخته بوسیله تکنیک انتقال هسته انجام گرفت.
مواد و روش ها
سلول هاي فیبروبلاست جنینی از جنین 35 روزه بز نژاد نجدي به منظور انتقال به تخمک بدون هسته تهیه شد. mRNA فاکتور 9 انعقادي خون انسان از سلول هاي کبدي استخراج و cDNA کد کننده آن ابتدا در وکتور pTZ57R/T کلون گردید. پس از تصحیح توالی ژن به روش Soeing PCR مجددا درون وکتور pTZ57R/T کلون شدد. نهایتا قطعه ژن خارج شده از T وکتور درون وکتور pBC1 در پایین دست پروموتر بتا کازئین گذاشته شد. در ادامه، به منظور درج کردن سازه ژنی درون ژنوم بز، وکتور hfIX-pBC1 از باکتري استخراج و با استفاده از آنزیم هاي برشی ژن مقاومت به آمپی سیلین حذف و سازه ژنی به صورت خطی در آمد.
سپس با استفاده از روش الکتروپوریشن سازه ژنی به درون هسته سلولهاي فیبروبلاست جنینی انتقال و سلول هاي ترانسفکت شده به روش single cell PCR با استفاده از پرایمر فلورسنس ، و در نهایت نمونه هاي مثبت با روشFISH تائید شدند. از روش تراکم کامل سلولی جهت به دست آوردن بهترین روش براي همزمان سازي همزمان سازي چرخه سلولی سلول دهنده با تخمک بالغ استفاده شد. 1678 تخمک نابالغ از 1057تخمدان هاي کشتارگاهی جمعآوري شده به محیط کشت بلوغ منتقل گردید. بدنبال بلوغ آزمایشگاهی ، سلول هاي کومولوس اطراف تخمک توسط آنزیم هیالورونیداز و ورتکس کردن از اطراف تخمک جداشده و پس از بررسی وجود اولین جسمک قطبی، 1152 تخمک بالغ شده جمع آوري گردید. تخمکهاي بالغ انتخاب شده و در محیط کشت Emcare قرار گرفتند. عمل بیهسته سازي به وسیله دستگاه میکرومانپولاتور انجام شد.
سلول ها ي همزمان شده در فاز G0/G1 سیکل سلولی به وسیله سوزن میکرواینجکشن به تخمک بی هسته شده منتقل گردیدند. تخمک هاي باز سازي شده با استفاده از دستگاه - electro cell manipulator - BTX تحت پالس الکتریکی قرار گرفته و فیوژ شدند. تخمک هاي فیوژ شده توسط یونومایسین و 6DMAP به صورت مصنوعی فعال سازي شدند. سپس جنین ها به محیط کشت Global منتقل شده و تا مرحله 4-8 سلولی کشت داده شدند. جنین هاي به لوله رحمی پذیرنده هاي از پیش همزمان شده با سن جنین منتقل شدند. عمل انتقال جنین با روش جراحی لاپاراتومی انجام می گیرد. تعداد جنین ها در هر انتقال 4 تا 6 عدد است.
تأیید تراریختگی بزغاله هاي متولد شده
با استفاده از پرایمرهاي اختصاصی ژن فاکتور 9 انعقادي انسان، واکنش PCR روي DNA ژنومیک استخراج شده از خون بزغاله هاي متولد شده انجام شد: در ادامه محصولات واکنش هاي PCR تعیین توالی گردیدند. تمام مراحل مذکور بر روي نمونه هاي کنترل مثبت - سازه ژنی - و کنترل منفی نیز شامل DNA ژنومیک بزهاي غیر ترانس ژن و فاقد الگو گذاشته شد.
نتایج
آنالیز سیکل سلولی
به منظور ارزیابی تأثیر تراکم کامل سلولی بر سیکل سلولی، محتواي DNA توسط آنالیز FACS اندازه گیري شد و در صد نسبی سلولهاي موجود در مراحل G0/G1 ، S و G2/M محاسبه شد. جدول 1 درصد سلولهاي در حال رشد را در فازهاي مختلف سیکل سلولی نشان می دهد . با استفاده از رنگ آمیزي دوتایی PI و FITC جمعیتهاي سلولی فاز G0 و G1 از هم تفکیک شدند - شکل . - 1
میزان کلیواژ حاصل از جنین هاي تراریخت
میزان تخمک هاي بدست آمده و بلوغ آنها در جدول2 نشان داده شده است. در این گروه 1678تخمک نابالغ از 1057 تخمدان کشتارگاهی استحصال شد 1/6 - تخمک/تخمدان - . 68 درصد تخمک ها به مرحله بلوغ رسیدند. 55 درصد جفت سیتوپلاست/کاریوپلاست اپس از انتقال هسته تشکیل شد. 95 در صد از جفت ها به صورت موفق فیوژ شدند. 70درصد تخمک هاي بازسازي شده فعال گردید و 52 درصد جنین بازسازي شده تشکیل شد. 64 جنین به بزهاي پذیرنده از قبل آماده سازي شده انتقال یافت که از این تعداد دو مورد حاملگی توسط اولتراسونوگرافی تأیید شد. یکی از آنها در پایان ماه دوم سقط شد. آزمایش هاي مولکولی انجام شده بر روي جنین، تراریختگی آن را تأیید کرد. بارداري دوم منجر به تولد بزغاله هاي دوقلو گردید - جدول . - 3
