بخشی از مقاله
چکیده
در تحقیق حاضر سنسوری الکتروشیمیایی با استفاده از آنزیم گلوکز اکسیداز برای تشخیص گلوکز در محلول آبی ساخته شد. بیوسنسور ساخته شده از نوع الکتروشیمیایی بوده و از الکترود کاری پلاتین بعنوان پایه ای برای تثبیت آنزیم و انتقال الکترون حاصل از واکنش آنزیمی استفاده شد. روش آمپرومتری برای بررسی عملکرد بیوسنسور الکتروشیمیایی به کار گرفته شد. جهت افزایش پایداری بیوسنسور، از کیتوسان و تلفیق روش بدام اندازی و محبوس سازی برای تثبیت آنزیم گلوکز اکسیداز استفاده شد. جهت افزایش عملکرد بیوسنسور، غلظتهای بهینه گلوکز اکسیداز و کیتوسان به ترتیب 5 mg/ml و 0/6 درصد وزنی تعیین شدند. در شرایط بهینه میزان پاسخ جریان 7/2 میکرو آمپر با زمان پاسخ 5 ثانیه به دست آمد. بررسی مورفولوژی سطح الکترود اصلاح شده نشان داد که لایه کیتوسان به طور مناسب و یکنواختی سطح آنزیم را پوشانده است. پایداری پاسخ بیوسنسور بعد از مدت زمان 30 روز بررسی شد. نتایج نشان داد بیوسنسور الکتروشیمیایی قادر به حفظ 97 درصد از پاسخ اولیه خود بوده است.
کلمات کلیدی:بیوسنور، کیتوسان، گلوکز اکسیداز، الکتروشیمیایی ، آنزیم
-1 مقدمه
با توجه به رشد روزافزون صنعت و تکنولوژی در سالهای اخیر توسعه روشهایی متناسب و همگام با این رشد در زمینه های مختلف ضروری می باشد. آنالیز و سنجش مواد در بخش های مختلف صنایع شیمیایی، دارویی و پزشکی یکی از شاخصه هایی است که بسیار حایز اهمیت می باشد، که هر اندازه روشهای آنالیز سریع تر و دقیق تر باشد ارزشمندتر می باشد .[2 , 1] در مورد گلوکز بعنوان ترکیبی مهم در صنایع غذایی و همچنین نیاز به تنظیم مداوم قند خون در بیماران دیابتی، اهمیت تشخیص و سنجش این ماده آشکار می گردد. بیوسنسورها ابزاری توانمند جهت شناسایی مواد آلی و مولکولهای زیستی می باشند .[4 ,3]
در حقیقت بیوسنسورها ابزارهای آنالیتیکی هستند که می توانند با بهره گیری از هوشمندی مواد بیولوژیکی، ترکیب یا ترکیباتی را شناسایی نموده و با آنها واکنش دهند. معمولا موادی را که بیوسنسور آنالیز میکند سوبسترا یا آنالیت می نامند. محصول واکنش حسگر با آنالیت می تواند یک پیغام شیمیایی، نوری، حرارتی و یا الکتریکی باشد .[1] در یک بیوسنسور، عنصر حسگر باید به نوعی به مبدلی متصل شود تا پاسخ اختصاصی حاصل شده به سیگنال قابل اندازه گیری تبدیل شود. در حقیقت یک بیوسنسور را می توان به عنوان ابزاری که از تلفیق یک عنصر بیولوژیکی متصل به یک مبدل حاصل می شود، تعریف نمود .[6 ,5]
مبدل های الکتروشیمیایی کابردی ترین روش در ساخت بیوسنسورها می باشد که که از لحاظ تجاری توسعه یافته اند. اصل اساسی در پس حسگرهای زیستی الکتروشیمیایی این است که واکنشهای شیمیایی یونها یا الکترونهایی را تولید یا مصرف می کنند، که به نوبهی خود باعث برخی تغییرات در خصوصیات الکتریکی محلولی که میتواند برای تشخیص و به عنوان مقیاس اندازهگیری استفاده شود، میگردد .[8 ,7] ولتامتری - آمپرومتری - ، پتانسیومتری و هدایت سنجی از روش های متداول در مبدل های الکتروشیمیایی می باشند .[9]در بیوسنسورهای آنزیمی گلوکز، گلوکز اکسیداز بعنوان عنصر بیولوژیکی کاربرد وسیعی دارد. این آنزیم از آنزیمهای اکسیدو ردوکتاز میباشد که قادر به کاتالیز نمودن فرآیند اکسیداسیون گلوکز به D-glucono-1,5-lactone و H2O2 میباشد .[10]
برای حفظ فعالیت آنزیم در بیوسنسور و جلوگیری از جدا شدن آنزیم باید به طریقی آن را در جایگاهش ثابت نمود که این عمل تثبیت آنزیم نام دارد. روش تثبیت به نوع آنزیم بستگی دارد و هر
روش مزایا و معایب خویش را دارد. مهمترین مزیت آنزیم تثبیت شده شامل کاهش هزینه عملیاتی، پایداری بیشتر آنزیم در حالت تثبیت شده، قابلیت متوقف کردن سریع واکنش با انتقال ساده آنزیم از محلول واکنش، قابلیت استفاده مکرر از آنزیم تثبیت شده و آلوده نشدن نمونه مورد نظر با آنزیم میباشد. .[11]پلیمر آلی کیتوسان یک پلیساکارید خطی است که از دی استیله شدن کیتین موجود در اسکلت خارجی حشرات، بندپایان، سخت پوستان - مانند میگو، خرچنگ - و دیوارههای سلولی قارچ ها، مشتق میشود .[13 ,12]
کیتوسان با قابلیت تشکیل غشایی فوق-العاده، زیست سازگاری خوب، ضریب نفوذپذیری بالا نسبت به آب، قابلیت چسبندگی، غیر سمی بودن و دارای استحکام مکانیکی بالا است که این خصوصیات، آن را به یکی از بهترین گزینهها برای تثبیت آنزیمها و بنابراین برای استفاده در کاربردهای تشخیص زیستی مبدل ساخته است .[15 ,14]در این تحقیق هدف ساخت سنسوری آنزیمی با قابلیت اندازه گیری آنی برای تشخیص گلوکز در فاز محلول می باشد. از آنجایی که سنسورهای آنزیمی معمولا از دناتوره شدن آنزیم در طول زمان و همچنین نشت آنزیم رنج می برند. در این تحقیق سعی شده است که این گونه معایب معمول بیوسنسورهای آنزیمی برطرف گردد. در این راستا آنزیم گوکز اکسیداز با استفاده از کیتوسان بر روی الکترود تثبیت شده و با بررسی آمپرومتری عملکرد بیوسنسور و تاثیر ماده تثبیت کننده بر روی پاسخ جریان و فعالیت آنزیم بررسی می شود. شرایط عملیاتی - غلظت آنزیم و مواد تثبیت کننده - بهینه گردید تا بیوسنسوری با سرعت پاسخ بالا و پایداری زمانی مناسب حاصل شود.
-2 مواد و روشها
-1-2 مواد شیمیایی
آنزیم گلوکز اکسیداز - - E.C. 1.1.3. 4, type X-S - استخراج شده از آسپرجیلوس نایجر از شرکت Sigma-Aldrich - آمریکا - تهیه شد که دارای فعالیت آنزیمی 153100 Ug-1 بود. از آنجایی که فعالیت آنزیمی گلوکز اکسیداز بسیار وابسته به دما بوده، پودر آنزیم در فریزر و در دمای -20 درجه سانتیگراد نگهداری میشد.کیتوسان - دی استیله - %85 با وزن مولکولی پایین تهیه شده از شرکت Sigma-Aldrich آمریکا در این پروژه استفاده شد. کیتوسان در pH های بالاتر از 6/3 بعلت دی پروتونه شدن گروههای آمینی، نامحلول بوده و در pH های اسیدی به صورت ژل قابل حل میباشد. برای تهیه محلول کیتوسان مقدار مورد نیاز از پودر کیتوسان درمحلول اسید استیک 1 درصد وزنی - pH=5/5 - حل شد و به مدت 30 دقیقه در دمای اتاق، محلول همزده شد تا یکنواخت گردد.
محلول 100 mM گلوکز بعنوان محلول ذخیره تهیه شد و به مدت 24 ساعت در دمای محیط قرار داده شد تا پدیده موتاروتاسیون صورت گرفته و محلول گلوکز به تعادل برسد. این کار برای یکسان سازی آزمایشها و به حداقل رساندن خطاهای آزمایش ضروری می-باشد.محلول بافر فسفات پتاسیم با ترکیب درصد مناسب از KH2PO4 و K2HPO4، بعنوان حاملی برای انتقال الکترون ایجاد شده در واکنش آنزیمی گلوکز در مدار الکتروشیمیایی انتخاب شد. همچنین برای جلوگیری از مهاجرت گونه های باردار شده در گرادیان میدان الکتریکی مقدار مورد نیاز از پودر کلرید پتاسیم به بافر اضافه شد تا محلول الکترولیت 1 M KCl + 0/1 M PB حاصل شود.
-2-2 سنجش الکتروشیمیایی
مبدل الکتروشیمیایی و روش آمپرومتری - در پتانسیل کاری 0/75 ولت - برای بررسی عملکرد نانوبیوسنسور انتخاب شد. جهت انجام آزمایشهای الکتروشیمیایی از سیستم متداول 3 الکترودی استفاده شد. برای بررسی نانوبیوسنسور جهت آنالیز گلوکز، از الکترود کاری پلاتین استفاده شد. الکترود رشته ای پلاتین بعنوان الکترود کمکی و الکترود Ag/AgCl بعنوان الکترود مرجع استفاده شد.
الکترودها از شرکت آذر الکترود - تبریز - تهیه شد. قطر الکترود کربن شیشه ای و پلاتین 2 میلی متر بود. الکترود پلاتین از نوع گردن پیچی بوده که قابلیت جدا سازی سر متحرک الکترود برای آنالیز SEM وجود داشت.
آزمایشها در یک سل شیشه ای الکتروشیمیایی حاوی محلول الکترولیت 0/1 مولار بافر فسفات پتاسیم انجام شد. دستگاه پتانسیواستات Ivium مدل A08085 ساخت کشور هلند برای انجام روش ولتامتری و آمپرومتری مورد استفاده قرار گرفت.برای تنظیم دمای محلول الکترولیت از هیتر همزن دار - - Velp, Scientifica, Italy مجهز به سیستم تنظیمی دمایی اتوماتیک استفاده شد. برای کاربردی کردن بیوسنسور، آزمایش ها در دمای ثابت 25 درجه سانتیگراد انجام شد.
-3-2 تثبیت آنزیم با استفاده از کیتوسان
با توجه به اینکه کیتوسان پلیمری طبیعی است که محیط زیست سازگاری آنزیم ها فراهم می کند از کیتوسان برای تثبیت گلوکزاکسیداز استفاده شد. طرز تهیه بیوسنسور مبتنی بر آنزیم و کیتوسان در شکل 1 به صورت شماتیک نشان داده شده است. در ابتدا 5 میکرولیتر محلول 5 میلی گرم بر لیتر گلوکز اکسیداز بر روی سطح الکترود پلاتین تزریق شده و الکترود به مدت 2 ساعت در مقابل جریان هوا قرار گرفته و خشک شد. سپس 10 میکرولیتر محلول کیتوسان %0/6 وزنی بر روی آنزیم خشک شده تزریق شد. میزان حجم محلول کیتوسان مصرفی در این مرحله مهم میباشد، زیرا مقدار کیتوسان کم به خوبی اطراف آنزیم را نمی پوشاند و نشت آنزیم رخ می دهد و همچنین میزان محلول زیاد باعث افزایش ضخامت لایه شده و میزان نفوذ و انتقال جرم را کاهش میدهد. پدیده ای که در این مرحله رخ می دهد به این صورت است است که آنزیم کیتوسان در داخل قطره کیتوسان حل شده و پخش می شود و در نهایت الکترود در مقابل فن و هوای آزاد به مدت 4 ساعت خشک میشود. مکانیزم استفاده شده برای تثبیت آنزیم از نوع محبوس سازی بوده است ولی با توجه به پخش شدن آنزیم در بخشهای داخلی کیتوسان میتوان این روش را تلفیقی از بدام اندازی و محبوس سازی به شمار آورد.
-3 نتایج و بحث
-1-3 بررسی تاثیر غلظت آنزیم
برای تعیین میزان بهینه غلظت آنزیم، الکترود پلاتین/گلوکز
