بخشی از مقاله
طراحی بیوسنسور میکروبی تشخیص آفلا توکسینM1 بر پایه باکتري بیولومینسانس V.fischeri
آلودگی محیط زیست یکی از مشکلات عمده ي جهان است که صنایع غذایی ونوشیدنی ها راتحت شعاع قرار داده است وارزیابی سطوح الـودگی بـراي سـلامتی جامعه امري حیاتی است . استفاده از بیوسنسور ها کاربرد روز افزونی در صنایع جهـانی پـردازش غـذا دارد. بیوسنسـور میکروبـی بیـو لومینسـانس، بـه عنـوان ابزارسریع، حساس و دقیق تا حد میکرو براي تشخیص وسنجش آلاینده هاي محیطی(سموم زیستی، آفت کش ها، فلزات سـنگین و....) داراي کـاربري اسـت. در مطالعهي حاضراز باکتري بیو لومینسانس ویبریو فیشري (Vibrio fischeri- NRRL B-11177) جهت سنجش کمی آفلا توکسـین M1 اسـتفاده شـده اسـت.
ابتدا نمودارتغییر شدت نشر نور همگام با رشد باکتري جهت تعیین زمان بهینه بکارگیري آن جهت بیوسنسور مشخص شد. تحقیقات نشان داد کـه بـازه زمـانی رشد باکتري30ساعت است وکشت 12-14ساعت با ماکزیمم نشر نوري لومینسانس براي طراحی بیوسنسورویبریوفیشري (v.fischeri)مناسب است. با توجه به اطلاعات بدست آمده،آزمایشی براي تعیین میزان دوز پاسخ دهی باکتري نسبت به غلظت هاي مختلف آنالیت طراحی شد. اثر مهارشدگی محلول آفلاتوکسـین در محدوده غلظتی(0/008ppt(ng/ml تا 0/2pptبر شدت نشر نور لومینسانس باکتري فوق بررسی شد. در صد مهار شدگی محلول آفـلا توکسـینM1درکمتـرین غلظت درزمان 5 ،10 و15 دقیقه به ترتیب 12,10 , 8 در صدتعیین شد.
واژگان کلیدي:بیولومینسانس ، v.fischeri، بیوسنسور میکروبی، کیت تشخیصی
مقدمه
در سال هاي اخیر افزایش آلودگی محیط زیست منجر به آلودگی مواد غذایی شده است که این الودگی ناشی از چندگانگی عمل در جامعه ي مدرن است. بیماري هاي وابسته به غذا در جهان در حال گسترش است. برخی از واریته هاي قارچ خاکی آسپرژیلوس فلاووس((Aspergillus flavusوآسپرژیلوس پارازیتیکوس (Aspergillus parasiticus.) آفلا توکسین تولید می کنند که سموم سرطان زا هستند وسرطان کبد را در حیوانات آزمایشگاهی القا می
کنند2]،.[8 کنترل ، تنظیم وتشخیص این سموم براي سلامتی انسان بسیار مهم است و کنترل کیفیت در طی فرآیند هاي تولید، یکی از نیازمند ي هاي اساسی در صنایع غذایی است . ارزیابی سطوح این آلودگی حیاتی بوده و استفاده از روش هاي متداول سنتی شیمیایی به دلیل محدودیت هاي خاص زمان بر، گران وغیر اختصاصی براي آنالیز هاي سریع ومعتبر امکان پذیرنیست. باتوجه به محدودیت این روشها در بررسی اثرات آنتاگونیست، سینرژیسم، سنجش سمیت آلاینده هاي محیطی، تعیین حد آستانه تشخیصی بعضی ترکیبات سمی، امروزه به روش هاي بیولوژیکی که فاقد محدودیتهاي روشهاي شیمیایی بوده بیشترتوجه شده است. در این روشها از موجودات زنده (پروکاریوتیک ویوکاریوتیک) به عنوان ابزارهاي بیولوژیکی درتشخیص و تعیین سمیت آلایندههاي مختلف استفاده میشود. گزارشات متعددي در زمینه استفاده از بیوسنسورهاي میکروبی به عنوان ابزار دقیق ، سریع، حساس براي تشخیص ترکیبات سمی محیطی شده است.[10] گزارشاتی در زمینه استفاده از بیوسنسورهاي میکروبی بیولومینسانس باکتريهاي مهندسی ژنتیک شده((GEM درتعیین سمیت((Toxicity آلا یندههاي زیستی ارائه شده است.[5 ] ویبریو فیشري باکتري دریایی گرم منفی از خانواده ویبریو ناسه که داراي ژنluxCDEAB و توان نشر طبیعی نور لومینسا نس درطول موج490 نانومتر را دارا است. اساس بیوشیمیایی نشر نور در باکتریهاي بیولومینسانس، واکنش اکسیداسیون آلدئید با زنجیره بلند و FMNH2 درحضور اکسیژن است که توسط آنزیم لوسیفراز((Luciferaseکاتالیز می شود و انرژي حاصل از واکنش به صورت نشرنور سبز آبی درطول موج490 نانومترخواهد بود که توسط دستگاه لومینومتر قابل اندازهگیري است.
نشر نوري در باکتري بیولومینسانس وابسته به ژنlux و فعالیت متابولیکی است. پاسخ باکتري در برابر آلایندهها به صورت مهار نشر نوري (مهار فعالیت آنزیم لوسیفراز )است. استفاده از این باکتري در تشخیص آلاینده هاي مختلف محیطی چون انواع حشرهکش ها، عناصر سنگین فلزي، سورفاکتانتها، ، توکسین ها درصنایع غذایی و غیره گزارش شده است
10]، 7و.[4 اهداف این پروژه، طراحی و بهینه سازي نشر نور بیولومینسانس باکتري ویبریو فیشري، با کاربري به عنوان بیوسنسور میکروبی درتشخیص ترکیبات توکسیک چون آفلا توکسینM1 بوده است.
مواد و روشها
ترکیبات شیمیایی مورد استفاده شامل پپتون باکتریایی، نمک دریایی ، عصاره مخمر، گلیسرول، سود، اسید کلریدریک، آفلاتوکسینM1 ، شیر پاستوریزه واز سویه لیوفیلیزه باکتري ویبریو فیشري استاندارد (NRRLB-11177) و محیط کشت اختصاصی باکتریاییSWC medium (پپتون باکتریایی5گرم، نمک
دریایی24 گرم، عصاره مخمر3گرم، گلیسرول3 میلی لیتر دریک لیتر آب مقطر) به شکل مایع وجامداستفاده شد(.(pH 6/5
روش کار
ابتدا نمونه باکتري لیوفیلیزه ویبریو فیشري، درمحیط مایع(Sea water complemenrt medium) SWC کشت شد و درشیکر انکوباتور( حرارت 25 درجه سانتیگراد و دور(200rpm به مدت 24-18 ساعت انکوبه شدو منحنی رشد باکتري در بازه زمانی 30 ساعت رسم شد. دانسیته سلولی نمونه ها با فاصله یک ساعت در بازه زمانی 30 ساعت به وسیله دستگاه اسپکترومتر (WPA,S2000 UV visible, UK) اندازه گیري و شدت نشر نور لومینسانس توسط دستگاه لومینومتر ( ( Berthold FB12 , Germany سنجیده شد.کلیه ازمایشات با سه تکرار انجام شد. کشت مجدداز باکتري پس از ازاطمینان خلوص نمونه باکتري، تهیه شد و نمونه به صورت کرایو بانک( (bead در فریزر-20 درجه سانتیگراد ذخیره شد. محلول استوك آفلاتوکسینM1 باغلظت 10ppt (ng/mL) انتخاب شد، سریال رقت هاي در محدوده غلظتی 0/008، 0/04و0/2، نانوگرم درمیلی لیتر ازمحلول استوك توکسین در آب مقطر استریل تهیه شد.آزمایشات به منظور بهینه سازي نشر نور باکتري طراحی شد به نحوي که تاثیر پارامترهاي مختلف از جمله حجم نمونه باکتري، تراکم باکتري و نسبت ترکیبات شیمیایی موجود در محیط کشت (پپتون، گلیسرول ،عصاره مخمر ) برمنحنی تغییر نشر نور بیولومینسانس باکتري در بازه زمانی 30 ساعت بررسی شد،از نمونه باکتري 8 روز فریزر (-20o C) براي سنجش آفلا توکسین انتخاب شد وحجم 5 میکرولیتر ازمحلول هاي آفلا توکسین(AFM1 ) M1 درغلظت 04/008،0/0، 0/2 نانوگرم در میلی
لیتر به حجم 20 میکرولیتر نمونه باکتري ویبریوفیشري تلقیح شد ومیزان پاسخ دهی باکتري در محدوده زمانی 15 دقیقه بررسی شد. سنجشها با سه تکرار انجام شد.
نتایج و بحث
(1دادههاي بدست آمده از رسم منحنی رشـد بـاکتري ویبریـو فیشـري، زمـان 12 تـا 14 سـاعته کشـت را بـه عنـوان زمـان بهینـه مشـخص نمـود کـه نشـر نـوري بـاکتري حـداکثر اسـت. فـاز سـکون ( Stationary phase ) بـاکتري بـه مـدت 20 سـاعت نشـان داده شـد. بـا رقیـق سـازي نمونـه هـاي بـاکتري
وتغییــر تــراکم ســلولی حــد آســتانه تشــخیص نشــر نــور در دســتگاه لومینــومتر تشـخیص داده شــد ومــدت مانــدگاري بــاکتري در ایــن فــاز از 20بــه 16
ساعت تغییر نشان داد(شکل.(1
شکل. .1 نموداربررسی تغییر شدت نشرنور بیولومینسانس همگام با رشد باکتري ویبریو فیشري در محدوده زمانی30 ساعت (a نمونه شاهد باکتري (b
نمونه رقیق شده به نسبت 1/10 ازباکتري RLU (Relative luminescence unit)
(2 داده هاي بدسـت آمـده از تغییـر نسـبت هـاي ترکیبـات پپتـون بـه گلیسـرول وگلیسـرول بـه عصـاره مخمـرو نسـبت درصـد گلیسـرول نشـان داد تغییـر محــیط باعــث مـی شـود کـه بـاکتري در تمــام دوره زنـدگی ، نشـر متـاثراز محــیط دارا باشـدکه گلیسـرول نقـش مهمـی در مانـدگاري نشـر نـور بـاکتري درطول فـاز سـکون داشـته اسـت وافـزایش پپتـون وعصـاره مخمـر، افـزایش فـاز لگـاریتمی رشـد بـاکتري را مشـخص نمـود (جـدول(1 بـا توجـه بـه نتـایج
