بخشی از مقاله
تثبیت آنزیم گلوکز اکسیداز برسطح تکلایه هاي خودآراي کربوکسیلیک انیدرید جهت ساخت زیست حسگر گلوکز
چکیده – روش جدیدي براي پیوند مستقیم آنزیمها بر روي تکلایه هاي خودآراي تیولی بر پایه طلا توسعه داده شد. روش تثبیت ساده و سریع است و آنزیم بسیار نزدیک به سطح طلا تثبیت می شود. مراحل تهیه و پاسخ زیست حسگر به گلوکز توسط CV، EIS و کرنوآمپرومتري بررسی شدند. اختلاف نسبی بین شیب و عرض از مبدا روش جدید و روش متداول یعنی استفاده ار معرفهاي فعال کننده EDC/NHS براي تثبیت به ازاي 5 مرتبه اندازهگیري هر منحنی کالیبراسیون توسط روش کرنوآمپرومتري، 10 و 8 درصد می باشد.
کلید واژه- تکلایه هاي خودآراي کربوکسیلیک انیدرید، زیست حسگر، طیف سنجی مقاومت ظاهري الکتروشیمیایی.
-1 مقدمه
تیولها میتوانند در سطح فلزات و یا اکسیدهاي فلزي جذب شوند. جذب ابتدا تصادفی بوده، سپس نظم گرفته و تکلایه هاي پایداري را تشکیل میدهد. این تکلایه ها فرصتی را براي ایجاد عاملهاي شیمیایی با دقت ملکولی فراهم آورده، و دستکاري سطح در ابعاد ملکولی را ممکن میسازند. بسته به این که ملکول آلی جذب شده بلند زنجیر یا کوتاه زنجیر، عامل دار یا بدون عامل باشد،سد عایقی در برابر انتقال الکترون ایجاد کرده، تغییرات چندانی در برابر سینتیک انتقال الکترون بوجود نیاورده، و یا حتی انتقال الکترون را تحریک و تشدید کند. این رفتار امکان پیگیري تغییرات ساختار تکلایه با وجود ابعاد نانومتري ملکولها را ساده میکند. ملکولهاي جذب شده بر روي سطح هادي میتوانندمستقیماً بهعنوان حسگر بهکار روند، و یا به عنوان سکویی با اصلاح بیشتر جهت ساخت حسگرها و زیست حسگرهاي الکتروشیمیایی مورد استفاده قرار گیرند. تشکیل تکلایه هاي خودآراي تیولی بر روي الکترود طلا یکی از بهترین روشها براي ایجاد گروههاي عاملی مناسب در سطح جهت ساخت حسگرها و زیست حسگرهاي الکتروشیمیایی میباشد. در میان این گروههاي عاملی، کربوکسیلیک اسیدها و آمینها از همه مناسبترند. بر اساس اطلاعات موجود در متون، تاکنون پیوند بین آمین آنزیم و کربوکسیلیک اسید انتهاي شاخه تک لایه خودآرا، از طریق فعال کردن و تقویت قدرت ترك کنندگی گروه هیدروکسیل موجود بر روي کربوکسیلیک اسید صورت گرفته است .[4-1] حضور این فعال کنندهها در محیط واکنش باعث بروز مشکلاتی نظیر واکنشهاي ناخواسته با آنزیم و آلوده شدن الکترود می شود.
این مشکلات، لزوم جستجو و تحقیق براي یافتن روشی ساده و بدون حضور فعال کننده را بیان میکند. بررسیهاي ما نشان دادند که تاکنون در مورد پیوند کووالانسی آنزیمها بر روي سطح تکلایه هاي خودآرا، بدون حضور معرف هاي فعالکننده گزارشی منتشر نشده است. در کار حاضر از مرکاپتوکربوکسیلیک اسیدها به عنوان یک پایه مناسب و از گلوکزاکسیداز به عنوان یک آنزیم ایده آل [5] استفاده کرده و یک روش جدید مبتنی بر عدم نیاز به معرف فعالکننده براي تثبیت آنزیمها در سطح طلا توسعه داده خواهد شد.
در این راستا از روش هاي الکتروشیمیایی نظیر ولتامتري چرخهاي (CV)، طیف سنجی مقاومت ظاهري الکتروشیمیایی (EIS)، و کرنوآمپرومتري بهره جسته، و مراحل تشکیل و پاسخ زیست حسگر را مطالعه مینماییم.
-2 بخش تجربی
الکترود طلاي بس بلورین ابتدا بطریقه مکانیکی (پرداخت کردن بر روي پارچه آغشته به آلومینا، و استفاده از حمام اولتراسونیک) و سپس بصورت الکتروشیمیایی (چرخش پتانسیل الکترود در محلولی از اسید سولفوریک) تمییز شد.
الکترود مذکور با آب دو بار تقطیر چندین بار شستشو داده شد و سپس با قرار دادن در یک محلول آبی 20 میلی مولار از مرکاپتوسوکسینیک اسید (MSA) بمدت 12 ساعت اصلاح شد. سپس با آب دوبار تقطیر شستشو شده و با گاز آرگون خشک شد و براي تثبیت آنزیم گلوکز اکسیداز به دو روش مورد استفاده قرار گرفت:
(الف) مسیر تثبیت باEDC/NHS ،الکترود Au-MSA SAM در محلول 0/1 مولار از بافر فسفات، pH 5/5 حاوي 0/002 مولار از EDC و 0/005 مولار از NHS براي مدت 2 ساعت قرار گرفت و پس از شستشو با همان بافر فسفات، در محلول 0/1 مولار از بافر فسفات، pH 7/0 حاوي 0/5 میلی گرم بر میلیلیتر از آنزیم گلوکزاکسیداز بمدت 1/5 ساعت قرار گرفت تا الکترودAu-MSA GOx SAM بدست آید.
(ب) مسیر تثبیت با تهیه انیدرید: در یک ویال شیشهاي 20 میلیلیتري، 10 میلیلیتر از محلول تازه از تري فلورو استیک انیدرید 0/1 مولار و تري اتیل آمین 0/2 مولار در -N,Nدي متیل فرمآمید تهیه شد، سپس الکترود Au-MSA SAM بمدت 20 دقیقه در این محلول قرار گرفت.
