بخشی از مقاله
چکیده
زمینه و هدف: کلسترول اکسیداز آنزیمی است که اکسیداسیون کلسترول را همراه با احیاي اکسیژن مولکولی به پراکسیدهیدروژن انجام می دهد . این آنزیم توسط برخی میکروارگانیسم هاي بیماریزا و غیر بیماریزا تولید می شود و ازمهمترین آنزیم هاي تجاري است که کاربردهاي وسیعی در صنایع مختلف پیدا کرده است. هدف از این مطالعه مدل سازي ساختار سه بعدي پروتئین و شناخت اسیدهاي آمینه ضروري درجایگاه فعال آنزیم توسط داکینگ مولکولی با هدف مهندسی آنزیم می باشد. روشها: ابتدا توالی نوکلئوتیدي و پروتئینی از پایگاههاي اطلاعاتی GenBank و Uniprot استخراج شدند.
جهت بررسی اولیه توالی ، از برنامه Blast استفاده شد و بهترین الگوي پروتئینی داراي ساختار PDB جهت ساخت مدل سه بعدي انتخاب شد. بررسی مناطق حفاظت شده بین توالی آنزیم مورد مطالعه و پروئیئنهاي هم خانواده آن با رویهم اندازي چندگانه با استفاده از برنامه ClustalW و ESpript انجام شد. ساختار سه بعدي آنزیم توسط همولوژي مدلینگ با برنامه Modeller ساخته شده و پس از ارزیابی و ترسیم نقشه راماچاندران، با روش شبیه سازي داکینگ مولکولی با کمک نرم اقزار Arguslab دنباله هاي آمینواسیدي ضروري در جایگاه فعال شناسایی شدند. . نتایج: نتایج داکینگ مولکولی نشان داد که چهار دنباله آمینواسیدي شامل Lys-340، His-55، Tyr-270 و Ser-322 نقش مهمی در شناسایی و برهمکنش با سوبسترا داشتند.
برهمکنشهاي مهم در واکنش آنزیمی هیدروفوبی و هیدروژنی بودندو پس از ترسیم برهمکنشها و بررسی مناطق حفاظت شده، دنیاله Ser-322 بعنوان بهترین کاندید جهت آزمایشات جهش زایی انتخاب شد. بحث و نتیجه گیري: نتایج بدست آمده نشان داد که داکینگ مولکولی می تواند ابزار مناسیی در آنالیز جایگاه فعال آنزیم کلسترول اکسیداز بوده و به طراحی منطقی مهندسی آنزیم کمک نماید.
کلمات کلیدي: کلسترول اکسیداز، داکینگ مولکولی، مهندسی آنزیم
-1مقدمه:
کلسترول اکسیداز آنزیمی است که اکسیداسیون کلسترول را همراه با احیاي اکسیژن مولکولی به پراکسیدهیدروژن انجام می دهد . این آنزیم توسط برخی میکروارگانیسم هاي بیماریزا و غیر بیماریزا تولید می شود و ازمهمترین آنزیم هاي تجاري دنیاست که کاربردهاي وسیعی در صنایع مختلف پیدا کرده است. هدف از این مطالعه مدل سازي ساختار سه بعدي پروتئین و شناخت اسیدهاي آمینه ضروري درجایگاه فعال آنزیم توسط داکینگ مولکولی با هدف مهندسی آنزیم می باشد.
-2موادها و روشها :1-2 استخراج توالی نوکلئوتیدي و پروتئینی آنزیم: توالی نوکلئوتیدي و پروتئینی از پایگاههاي اطلاعاتی GenBank و Uniprot استخراج شد. شماره دسترسی - Accession number - توالی mRNA ، AB116146 و شماره دسترسی توالی پروتئینی، Q765A9 بود.
:2-2 ذخیره فایل PDB پروتئین: فایل PDB پروتئین با کد 4RSL از پایگاه PDB گرفته شد.
:3-2 ترسیم اشکال سه بعدي سوبستراها و مینی مایز کردن انرژي: سوبستراهاي مورد استفاده در مطالعات داکینگ و مهندسی آنزیم شامل فروکتوزیل والین و فروکتوزیل والین هیستیدین بودند. اشکال سه بعدي آنها توسط برنامه ChemDraw از نرم افزار ChemOffice 2004 ترسیم شد و مینی مایز کردن انرژي توسط برنامه Chem3d Ultra انجام گرفت.
:4-2 شناسایی دنباله هاي آمینواسیدي مهم در جایگاه فعال درشناسایی و مشخص کردن اسیدهاي آمینه تاثیرگذار در اتصال به سوبسترا از اطلاعات مربوط به کریستالوگرافی پروتئین، رویهم اندازي چندگانه توالیها و داکینک مولکولی آنزیم-سوبسترا استفاده شد.
:5-2 رویهم اندازي توالی پروتئینی با توالیهاي آنزیمهاي دیگر: جهت بررسی مناطق حفاظت شده بین توالی آنزیم مورد مطالعه و پروئیئنهاي هم خانواده آن، رویهم اندازي چندگانه با استفاده از برنامه ClustalW و ESpript انجام شد. براي این منظور توالی پروتئینهاي هم خانواده آنزیم فروکتوزیل آمینواسید اکسیداز از پایگاه Uniprot استخراج شد.
:6-2داکینگ آنزیم-سوبسترا بمنظور شناسایی دنباله هاي آمینواسیدي دخیل در برهمکنش با سوبستراها، داکینگ مولکولی سوبسترا هاي فروکتوزیل والین و فروکتوزیل والین هیستیدین به آنزیم فروکتوزیل آمینواسید اکسیداز توسط نرم افراز Autodock Vina انجام شد. در داکینگ از نرم افراهاي دیگري شامل AutoDock tools، PyMol، Python و Ligplot نیز استفاده شد. مولکولهاي اضافی همراه آنزیم شامل حلال آب و لیگاندهاي فسفات و FAD حذف شدند و ساختار پروتونه شده براي pH خنثی تنظیم شد. محفطه مکعبی شکل - Grid Box - با ابعاد 27/501 x 49/182 x 19/732 با فضاي یک آنگسترومی و مرکز مکعب تعریف شد. در انتها نیز برهمکنش لیگاندها با پروئتین هدف در ساختارهاي داك شده توسط نرم افزار LigPlot ترسیم شد .
-3نتایج و بحث:
با توجه به نتایج داکینگ و اطلاعات بدست آمده از کریستالوگرافی انجام شده، چهار دنباله آمینواسیدي Arg-62، Tyr-261، His-377 و Lys-380 جهت ایجاد جهش و تغییر به 19 اسید آمینه دیگر در محیط In silico انتخاب شدند. همچنین دو اسید آمینه حفاظت شده Lys-27 و Ser-375 بعنوان کنترل آزمایشات داکینگ در نظر گرفته شدند. نتایج داکینگ واریته هاي جهش یافته با سویستراها و دنباله هاي آمبنواسیدي درگیر در پیوند با آنها در جدول 1 نمایش داده شد. بهترین نتایج بدست آمده بصورت برجسته مشخص شدند. نحوه برهمکنش نیز در شکل 1 نمایش داده شد.
