بخشی از مقاله
چکیده
کاربرد آنزیم کولین اکسیداز در بیوسنسورهای آنزیمی به منظور آشکارسازی ارگانوفسفره ها باعث شده تا مطالعات زیادی بر روی بر هم کنش این آنزیم با ارگانوفسفره ها انجام پذیرد. در این مقاله اثر دو ارگانوفسفره پاراکسون و اتیل پاراتیون بر روی ساختمان آنزیم کولین اکسیداز مورد بررسی قرار گرفته است. به همین منظور سه پارامتر ترمودینامیکی آنتالپی، انرﮊی آزاد گیبس و انتروپی برهم کنش عوامل فوق با کولین اکسیداز به روش اسپکتروفتومتری نشر فلورسانس اندازه گیری شده و سپس.مقایسه گردید. نتایج این تحقیق نشان داد که هر دوی این عوامل بر روی ساختار آنزیم اثر دناتوره کنندگی دارند. اما پاراکسون در مقایسه با اتیل پاراتیون، دارای اثر هیدروفوبیک بیشتری بوده و شدیدتر ساختار آنزیم را تحت تاثیر خود قرار می دهد و انتروپی بیشتر آن ناشی از همین واقعیت است.
کلمات کلیدی: پارامترهای ترمودینامیکی، بیوسنسورهای آنزیمی، کولین اکسیداز، پاراکسون، اتیل پاراتیون
مقدمه
کاربرد بسیار وسیع ارگانوفسفره ها در کشاورزی - به عنوان آفت کش - ب٢و١م، در پزشکی - به عنوان مهارکننده های استیل کولین استراز - ب٣م و حتی در تهاجم های نظامی - آن گونه که درجنگ تحمیلی و بویژه در حلبچه بوقوع پیوست - ب٤م، آشکارسازی این عوامل را از نقطه نظر زیست محیطی، پزشکی و نظامی بسیار حائز اهمیت ساخته است. کولین اکسیداز x - قلاه - آنزیمی است که به همراه استیل کولین استراز بر سطح الکترودهای مناسب تثبیت می شود ب٥م. چنین ساختاری، بیوسنسور آنزیمی نامیده شده و برای آشکارسازی - مطالعه کیفی - ب٥م و اندازه گیری غلظت ارگانوفسفره ها - مطالعه کمی - ب٦م مورد استفاده قرار می گیرد. آگاهی از مکانیزم تاثیر آنالیت ها - ترکیباتی که مورد آشکارسازی قرار می گیرند - بر ساختار طبیعی آنزیم هایی که در بیوسنسورها مورد استفاده قرار می گیرند، امکان ساخت بیوسنسورهای با کارآیی بیشتر را فراهم می آورد.
علی رغم کاربرد زیاد کولین اکسیداز در ساخت بیوسنسورهای آنزیمی، اطلاعات زیادی در مورد تاثیر گانوفسفره ها بر ساختار طبیعی آن در دستزس نمی باشد. در این مقاله بر هم کنش دو ارگانوفسفره پاراکسون - گقبض و اتیل پاراتیون A - بغ - با آنزیم xقلاه مورد بررسی قرار گرفته است. xقلاه مانند همه پروتئین ها، برای انجام نقش های ساختاری و یا کاتالیتیکی - آنزیمی - خود، بر اساس رابطه منطقی ساختار- عملکرد - غپطصطغأًسغپطصهعطپسغپه - به ساختار طبیعی - کهطصهش - خود وابسته استب٧ مو مطالعه شایداری آن در مقابل عوامل فیزیکی - مانند دما و فشار - و یا عوامل شیمیایی - مانند انواع دناتوره کننده ها - مورد توجه پژوهش گران متعددی قرار گرفته استب٨م. پارامترهای ترمودینامیکی مانند انتالپی، انرﮊی آزاد گیبس و انتروپی برهم کنش، برای ارزیابی پایداری پروتئین ها در مقابل عوامل دناتوره کننده فیزیکی و یا شیمیایی، شاخص های قابل قبولی به شمار می آیندب٩و١٠م. در پژوهش انجام شده برای بررسی برهم کنش گقب و Aبغ با آنزیم xقلاه به منظور تعیین میزان پایداری آنزیم در مقابل این ارگانوفسفره ها، ازاندازه گیری پارامترهای ترمودینامیکی مذکور به روش اسپکتروسکپی نشرفلورسانس استفاده شده است
مواد وروش ها
کولین اکسیداز، پاراکسون و اتیل پاراتیون از شرکت سیگما تهیه گردید. برای تهیه بافر از پتاسیم فسفات جخقبلدل , خقبدللض محصول شرکت مرک و در همه آزمایش ها از آب دو بار تقطیر برای تهیه محلول های مور نیاز، استفاده شد. برای اندازه گیری ماکزیمم نشر فلورسانس، محلول آنزیمی xقلاه در بافر پتاسیم فسفات با ٨ دژ تهیه گردید. سپس برای تهیه کمپلکس های گقبسxقلاه و Aبغسxقلاه غلظت های مختلفی ازگقب و یا Aبغ به محلول آنزیمی اضافه شد. حجم محلول ها در درون سل فلورسانس ئع ١ و غلظت آنزیم درون آن قμ٣٢/٢ بود. برای انجام آزمایش فلورسانس، دستگاه اسپکتروسکپی فلورسانس طلاطهصطد مدل خسًبق که مجهز به سیستم کنترل دما هعطکلاصپطب مدل خس1Bش بود، مورد استفاده قرار گرفت.
شکل ١- نشر فلورسانس کولین اکسیداز. محلول آنزیمی با غلظت ٣٢/٢ میکرومولار در بافر پتاسیم فسفات، با غلظت های ٠، ٢/٤، ٤/٨، ٦/١٢، ٨/١٦، ٢٠، ٤/٢٨ و ٨/٣٦ میکرومولار پاراکسون - POX - و اتیل پاراتیون - طPم - در دو دمای ٢٥ - گراف هایشلاتط - و ٣٧ - گراف های حتنحشدرجه سانتیگراد انکوبه شده است. گراف های ط و ن مربوط به پاراکسون و لا و ح مربوط به اتیل پاراتیون است. بیشترین نشر فلورسانس برای آنزیم طبیعی و کمترین آن برای آنزیم کاملا باز شده اتفاق می افتد.
مطالعه طیف نشر فلورسانس پروتئین ها امکان تمایز و مطالعه ساختارهای طبیعی جکهطصهشض و باز شده 2 - ئپسغسض پروتئین ها را فراهم می آوردب١٢م. مطالعاتی که تا کنون بر روی طیف فلورسانس پروتئین ها انجام شده، این واقعیت را بیان می کند که بیشترین شدت نشر فلورسانس مربوط به حالت طبیعی و خاموشی - ؟غطلاطغکأذ - نشر فلورسانس حالت باز شده گی 2 - ئپسغس - آنها را نشان می دهدب١٢م. شکل ١ A - تا خض کاهش شدت نشر فلورسانس xقلاه را با افزایش غلظت ارگانوفسفره های گقب یا Aبغ نشان می دهد. در این شکل طیف های ه مربوط به حالت طبیعی و طیف های 2 مربوط به حالت باز شده گی کاملxقلاه است. اگر چه گزارش هایی وجود دارد که حاکی از جابجایی قرمز و یا آبی طیف نشر فلورسانس در این شکل طیف های ه مربوط به حالت طبیعی و طیف های 2 مربوط به حالت باز شده گی کاملxقلاه است. اگر چه گزارش هایی وجود دارد که حاکی از جابجایی قرمز و یا آبی طیف نشر فلورسانس بعضی از پروتئین های باز
