بخشی از مقاله
چکیده
آفلاتوکسین M1 بهعلت تاثیرات نامطلوب بر روی کبد، سیستم ایمنی و سرطانزایی از نظر سلامت عمومی اهمیت ویژهای را به خود اختصاص داده است. محصولات لبنی از جمله کشک از فراوردههایی هستند که بهعلت پایداری سم و نیز نوع فرآیند تولید احتمال وجود آفلاتوکسین در آنها بیشتر است. هدف این مطالعه، شناسایی آفلاتوکسین M1 در کشکهای سنتی و صنعتی بود.
برای این منظور پس از جمع آوری 80 نمونه بصورت تصادفی و آماده سازی آنها به روش استاندارد، میزان آفلاتوکسین به روش کیت الایزا سنجش شد. آنالیز دادهها به روش واریانس یکطرفه و تست دانکن صورت پذیرفت. طبق نتایج حاصل شده 17/5 درصد نمونههای کشک سنتی و 75 درصد کشکهای صنعتی آلوده به سم آفلاتوکسین قابل تشخیص M1 بودند.
میانگین آلودگی کشکهای سنتی34/29±10/78 و کشکهای صنعتی244/50±9/83 نانو گرم بر کیلوگرم بود. همچنین در 29 عدد از نمونههای کشک صنعتی و 5 نمونه سنتی نیز آلودگی بیش از استاندارد - 100 نانو گرم بر کیلوگرم - مشاهده گردید. از طرفی بین برخی برندهای صنعتی و نیز مقایسه سنتی با صنعتی نیز اختلاف معنادار از نظر آفلاتوکسین مشاهده شد
با توجه به نتایج این تحقیق لازم است که کنترلهای دقیق و منظم بر شیرهای تولیدی و مورد مصرف برای تولید فرآوردههای لبنی سنتی و صنعتی و نیز محصولات موجود در بازار مصرف به منظور اطمینان از عاری بودن از آفلاتوکسین M1 انجام شود.
مقدمه
گسترش روز افزون سرطان در جوامع بشری توجه به علل ایجاد کننده آن بخصوص از طریق آلوده کنندههای مواد غذایی را پیش از پیش روشن نموده است. انسانها و حیوانات اغلب از طریق مصرف مواد غذایی حاوی توکسینهای طبیعی در معرض خطرات زیستی قرار میگیرند. توکسین از نظر تعریفی ماده ای می باشد که توسط یک گونه گیاهی، حیوانی و یا میکروارگانیسم ساخته شده و برای سایر میکروارگانیسمها مضر میباشد.
مایکوتوکسین از ترکیب واژه یونانی قارچ - Mykes - و کلمه لاتین توکسیکوم - Toxicum - به معنی سم تشکیل شده است. آنها می توانند در هر دو محیط معتدل و گرمسیری جهان و در کشورهای صنعتی و در حال توسعه بر حسب گونه قارچی رخ دهند
با این حال شرایط محیطی به خصوص رطوبت بالا و درجه حرارتهای مطلوب قارچها در آلودگی مواد غذایی موثر است . - 2 - مایکوتوکسینها متابولیتهای ثانویه تولید شده برخی از گونهای قارچی که عمدتاً متعلق به جنسهای آسپرژیلوس، پنیسیلیوم و فوزاریوم میباشند. چنین ترکیباتی ممکن است توسط قارچهای مولد مایکوتوکسین در زمان تولید، فراوری، حمل و نقل و در طول مدت نگهداری در غذاهای آلوده رشد کنند.
آفلاتوکسینها، تریکوتسینها، زرالنون، دئوکسی زوالنون، فومانوزین، پاتولین، اکراتوکسین و ارگوتامین مایکوتوکسین-های اصلی هستند که بدلیل اثرات منفی بر روی سلامتی و اقتصاد انسان، سلامت تولید غذا و فراوری غذا را به چالش کشانده است 3 - و. - 4 بر طبق گزارش-های سازمان خوار و بار جهانی 25 - FAO - درصد دانههای غذایی کل دنیا به طور قابل توجهی با مایکوتوکسینها آلوده هستند.
آفلاتوکسین یکی از مهمترین مایکوتوکسینها می باشد که توسط گونهای مختلف جنس آسپرژیلوس عمدتاً آسپرژیلوس فلاووس و آسپرژیلوس پارازیتیکوس تولید میشود . - 5 - مایکوتوکسینها آلودگیهای طبیعی مهم مواد غذایی خام شامل غلات و حبوبات، دانههای روغنی، قهوه، آجیلها، ادویهها و میوههای خشک همچنین در غذاهایی با منشاء حیوانی از جمله شیر و فرآوردههای لبنی در سراسر دنیا هستند و نگرانی جدی برای سلامتی انسان و حیوان محسوب میشوند
بر طبق یافتههای بات و همکاران در سال 2010 حداقل 18 نوع مختلف از آفلاتوکسینها شناسایی شده است و آفلاتوکسین - AFB1 - B1، - AFB2 - B2، G1 - AFG1 - و - AFM1 - M1 مهمترین آنها از نظر ایمنی غذا میباشند
آلودگی شیر و فراورده های لبنی با مایکوتوکسینها میتواند بهصورت آلودگی غیر مستقیم زمانی که حیوانات شیرده غذای آلوده با AFB1 را تغذیه میکنند و به فرم AFM1 در شیر ظاهر میشود و یا به صورت آلودگی مستقیم زمانی که قارچها در شیر - با احتمال کم - و یا بر روی محصولات لبنی به صورت افزودنی عمدی و یا آلودگی تصادفی رشد کنند . - 9 - بنابراین شیر و فراوردههای لبنی نسبت به آلودگی AFM1 حساساند و به عنوان خطر مهم برای سلامت انسانها در نظر گرفته میشوند
آفلاتوکسینها به دلیل اثرات بالقوه خطرناکی که بر روی کبد، القا تومور، سرکوب سیتم ایمنی، جهش زایی، ناقص الخقه زایی و اثرات سرطانزایی دارند از نظر سلامت عمومی حائز اهمیت اند . - 11 - آفلاتوکسینها متابولیتهای قارچی تولید شده توسط حداقل 20 گونه از جنس آسپرژیلوس هستند . - 12 - اگرچه همه این 20 گونه تولید کننده آفلاتوکسین هستند ولی آسپرژیلوس فلاووس و آسپرژیلوس پارازیتیکوسبیشتر معروف اند. معمولاً آفلاتوکسینها در درجه حرارتهای پایینتر از درجه حرارت بهینهه رشد این گونهها تولید میشوند
تشکیل مایکوتوکسینها یک پروسه مداوم نیست اما اگر قارچ مولد مایکوتوکسین در محیط حضور داشته باشد توانایی تولید توکسین را دارد و مایکوتوکسین در غذا حضور خواهد داشت. علاوه بر این ممکن است خود قارچ در غذا نباشد ولی مایکوتوکسین تولید شده در غذا حضور داشته باشد . - 14 - آفلاتوکسینها مولکولهایی کم وزن هستند ولی دامنه سمیت آنها گسترده می-باشد. در غلظتهای کم فعال هستند.
در برابر نور ماوراء بنفش ناپایدارند ولی در درجه حرارتهای بالای 100 درجه سانتیگراد هم پایدار میمانند حتی زمان پختن، سرخ کردن و پاستوریزاسیون هم تقریباً دست نخورده باقی میمانند 14 - و. - 15 به همین دلیل است که AFM1 در شیر تحت پروسههای حرارتی از جمله پاستوریزاسیون و استرلیزاسیون به طور قابل ملاحظه ای قرار نمی گیرد .
با توجه به اهمیت آفلاتوکسینها از نقطه نظر سلامتی سازمانهای متولی بهداشت در سطح کشوری و بین المللی برای حداکثر مجاز آنها در مواد غذایی مختلف و نیز محصولات لبنی حدودی را مشخص نموده اند که این میزان برای AFM1 در شیر خام طبق استاندارد FDA و کمیته غذایی کدکس، 500 - 500 ppm نانوگرم بر کیلوگرم - و طبق استاندارد اتخادیه اروپا 50ppm تعیین شده است. همچنین طبق استاندارد ایران حد مجاز برای AFM1 در کشک 100ppm تعیین گردیده است
شیر و فراوردههای لبنی به دلیل اینکه از نظر مواد مغذی بسیار غنی می شدبا معمولاً توسط همه گروههای سنی مصرف میشود و از نظر تغذیه انسانی بسیار حائز اهمیت میباشد. کشک یکی از فراورده های لبنی سنتی با تاریخ کهن در ایران میباشد به طوری که در شاهنامه هم از واژه کشک استفاده شده است. در حقیقت کشک از واژه خشک گرفته شده است که نشان دهنده این است که در تهیه این محصول خشک کردن وجود دارد. امروزه کشک به صورت سنتی و صنعتی وجود داشته و در انواع غذاهای ایرانی استفاده میشود
کشک اغلب به شکل خشک و یا مایع غلیظ در دسترس است که معمولاً با جوشاندن ماست یا دوغ تهیه میشود. کشک مایع معمولا از رقیق کردن کشک خشک تهیه میشود ولی کشک مایع از تبدیل شیر به ماست و سپس تغلیظ و افزودن نمک و سایر افزودنیها و پاستوریزاسیون تهیه میشود
کشک یک ماده مغذی میباشد که حاوی درشت مغذیها از جمله - پروتئین، کربوهیدراتها و چربی - و ریز مغذیها از جمله کلسیم و فسفر میباشد. کلسیم موجود در کشک از نظر سلامت استخوانها و دندان اهمیت دارد. همچنین پروتئین موجود در کشک اسید آمینه های ضروری که ارزش بیولوژیکی بالایی را دارند فراهم میکند. کشک به دلیل اینکه از نظر مواد مغذی بسیار غنی است به راحتی در معرض آلودگی با میکروارگانیسمهای مختلف از جمله قارچها و باکتریها قرار میگیرد. منبع اصلی آلودگی کشک شیر اولیه و نیز ماست برای تهیه این محصول میباشد که در صورت آلوده بودن به مایکوتوکسین آلودگی به کشک هم انتقال خواهد یافت
از طرفی در بسیاری از مناطق ایران و نیز استان آذربایجان غربی تولید و عرضه کشک سنتی در مقیاس قابل توجهی وجود داشته و تمایل به مصرف آن در بین بسیاری از مصرف کنندگان وجود دارد. بیشتر تحقیقات در ارتباط با جستجو و اندازه گیری آفلاتوکسینها در شیر و نیز پنیر صورت گرفته است و مطالعات کمی بر روی بررسی حضور آفلاتوکسین M1 در کشک بهخصوص از نوع سنتی انجام شده است.
از معدود مطالعات بر روی کشکهای پاستوریزه میتوان به تحقیق فلاح و همکارانش در 2011 اشاره نمود که با روش TLC حضور AFM1 را ارزیابی نمودند . - 6 - همچنین امیرپور و همکارانش در سال AFM 1 1394 را در کشکهای پاستوریزه توزیع شده در شهر تهران را با روش HPLC بررسی کردند . - 26 - ولی مطالعه ایی که در آن کشکهای سنتی مورد ارزیابی قرار گرفته و نیز با نمونه های صنعتی پاستوریزه مقایسه گردند یافت نگردید. لذا با توجه به اهمیت موضوع هدف این مطالعه شناسایی و مقایسه آفلاتوکسین M1 در کشکهای سنتی و پاستوریزه شمال غرب استان آذربایجان غربی به روش غربالگری با استفاده از کیت الایزا بود.
مواد و روش کار
مواد و معرفهای مورد استفاده:
تمام مواد شیمیایی شامل دی کلرو متان و هپتان با درجه خلوص بالا و از شرکت مرک آلمان - Merck Darmstadt Germany - و استانداردهای مورد استفاده آفلاتوکسین M1 در محدوده pg/ml 200- 6/25 و بافر رقیق سازی نمونهها از شرکت یوروپروکسیمای هلند - Europroxima Netherlands - تهیه گردیدند.
جمع آوری و آماده کردن نمونهها:
برای انجام آزمایشات در مجموع 40 نمونه سنتی عرضه شده در بازارهای شهرستان ارومیه و شهرهای تابعه استان در فصول بهار و تابستان 1395 و 40 نمونه پاستوریزه صنعتی از 4 برند پر تولید از فروشگاههای معتبر زنجیره ایی خریداری گردید. در مورد نمونه های پاستوریزه تاریخ مصرف نمونهها نیز کنترل گردیدند. نمونهها در در دمای یخچال به آزمایشگاه منتقل و تا زمان آزمایش - حداکثر 2 هفته - در دمای 4 درجه سانتیگراد نگهداری شدند. برای آماده سازی 2 گرم از هر نمونه پس از آسیاب کردن در مورد نمونههای سنتی و هموژنیزه کردن - Ultra-Turrax® T50 Basic, IKA, Germany - در مورد نمونههای صنعتی با 8 سی سی دی کلرو متان بمدت 30 دقیقه مخلوط گردید.
سپس با استفاده از فیلتر 9 - Macherey-nagel- 531009, Germany - سانتی متری فیلتر شده. 4 سی سی از محلول فیلتر شده برداشت شد و در 50 درجه سانتیگراد با استفاده از جریان گاز نیتروژن ملایم خشک شد. در مرحله بعد یک سی سی بافر رقیق سازی نمونه و یک سی سی هپتان بمنظور چربی زدایی افزوده شد. در نهایت پس از سانتریفیوژ - , Sigma 3K30 g 2000 - Laborzentrifugen GmbH, Germany بمدت 5 دقیقه، 100 میکرولیتر از فاز زیرین بمنظور اسفاده در میکروپلیت الایزا برداشت شد.
تعیین AFM1 بروش الایزا
بهترین و مدرن ترین روش اندازه گیری AFM1 در شیر روش الایزا میباشد که به علت سرعت در تشخیص، دقت فوق العاده و حساسیت زیاد به عنوان یک تست غربالگری خوب در این زمینه مطرح است. روش الایزای مستقیم بکار رفته در این تحقیق با استفاده از کیت یوروپروکسیما ساخت کشور هلند انجام گرفت. لازم به ذکر است که تمامی مراحل انتقال و جابجایی این کیتها در مجاورت یخ صورت گرفت.
