بخشی از مقاله
چکیده :
آرسنیک یکی از مشکلات جدی محیط زیست محسوب می شود چرا که سمیت این عنصر بالا بوده حتی در غلظت های بسیار پایین می تواند سلامتی انسان را به مخاطره بیاندازد و تقریبا در اکثر مناطق صنعتی و زراعی وجود دارد. جهت زدودن آن از طبیعت بهتراست از روش زیست پالایی و با استفاده از سویه های باکتریایی مقاوم و جاذب آرسنیک استفاده نمود.
در این پژوهش باکتری های مقاوم و یا جاذب به آرسنیک - آرسنات سدیم - جداسازی ، شناسایی و خصوصیات آن ها تعیین شد. به منظور جداسازی باکتری های مقاوم نمونه خاک و پساب از چندین جایگاه صنعتی و زراعی بر روی محیط کشت لوریابتانی آگار واجد آرسنات سدیم کشت داده شد. مقاومت سویه های جدا شده به آرسنات سدیم با توالی غلظت 5000-200000ppm ارزیابی گردید و حداقل غلظت فلزی مهارکننده رشد - MIC - و حداقل غلظت کشنده فلزی - MBC - سویه های منتخب بررسی گردید.
مقدمه :
تجمع فلزات سنگین در آب، هوا و خاک، یک مشکل زیست محیطی بسیار مهم می باشد. یکی از اساسی ترین مسائل در ارتباط با فلزات سنگین عدم متابولیزه شدن آنها در بدن می باشد. در واقع فلزات سنگین پس از ورود به بدن دیگر از بدن دفع نشده بلکه در بافت هایی مثل چربی، عضلات، استخوانها و مفاصل رسوب کرده و انباشته می گردندکه همین امر موجب بروز بیماریها و عوارض متعددی در بدن می شود. [4]
فلزات سنگین در یک مقیاس وسیع، از منابع طبیعی و انسان-ساخت وارد محیط زیست می شوند. میزان ورود فلزات سنگین به داخل محیط زیست، بسیار فراتر از میزانی است که به وسیله فرایندهای طبیعی برداشت می شوند . [4] اولین عامل اثرات آلودگی فلزات در یک اکوسیستم، وجود فلزات سنگین در بیومس یک منطقه آلوده است که سلامت انسان را به مخاطره می اندازد. [9]
آرسنیک یکی از مشکلات جدی محیط زیست محسوب می شود ودراتمسفر، خاک، سنگ، آبهای طبیعی و موجودات زنده یافت می شود. بیش از 245 نوع از کانیهای حاوی ارسنیک که بیشتر با سولفیدها ، مس ، نیکل ، سرب ، کبالت و دیگر فلزات همراه می باشند، شناخته شده است. حضور ارسنیک در محیط زیست علاوه بر منشا طبیعی ، دارای منشا انسانی نیز می باشد.آرسنیک به دو صورت آلی و غیرآلی در محیط وجود دارد که نوع غیر آلی آن بسیار سمی است. رایج ترین ترکیبات آرسنیک عبارتند از فرم غیرآلی آرسنیت و آرسنات و فرم آلی متیل آرسنیک اسید و د ی متیل آرسنیک اسید. [5]
روشهای مختلف شیمایی و فیزیکی جهت پاکسازی آب و فاضلاب از آرسنیک شناخته شده است . از جمله این روشها می توان به اکسیداسیون ، رسوب گذاری ،جذب توسط مواد جاذب و کلوئیدهای منعقد کننده ، تبادل یونی ، تفکیک غشایی ، غیر محلول کردن ، اکسید های آهن هیدراته ،کاهشpH آب های آلوده ، اولترافیلتراسیون ، الکتروشیمیایی اشاره نمود[6] زیست پالایی یا Bioremediation فرایندی است که طی آن آلاینده ها توسط موجودات زنده، عمدتا میکروارگانیسمها، در شرایط کنترل شده تجزیه شده و به حالت غیر زیانآور میرسد، یا اینکه غلظت آنها به حد کمتر از مقدار مجاز سازمانهای قانونگذار میرسد.
علاوه بر میکروارگانیسم ها ،گیاهان و قارچ ها نیز عمل زیست پالایی را انجام می دهند. زیست پالایی برای نابودی مواد شیمیایی در خاک، آب زیرزمینی، فاضلاب ، لجن ، پسماند های صنعتی و گازها به کار می رود .[8] در دهه های اخیر استفاده هر چه بیشتر از روش های زیستی جهت زدودن آلودگی محیط زیست مورد توجه قرار گرفته است. این روش ها معمولامقرون به صرفه و از همه مهمتر با محیط زیست سازگار می باشند .[7] با توجه به اهمیت استفاده از میکروارگانیسم ها در کاهش و حذف فلزات سنگین از محیط زیست تحقیق حاظر با اهداف زیر انجام شده است :
.1 جداسازی و شناسایی باکتری - های - مقاوم یا جاذب آرسنیک
.2 تعیین خصوصیت باکتری - های - منتخب
.3 بررسی مکانیزم جذب یا مقاومت به آرسنیک
پیشینه و تحقیق :
▪ رابینی آهور اسما وهکارانش در سال 2007 تنوع ژن های تبدیل آرسنیت از باکتری های مقاوم به آرسنیک را گزارش کردند. در این مطالعه فراوانی و تنوع باکتری مقاوم به آرسنیک در دو نمونه خاک با سطوح مختلف آلودگی آرسنیک بررسی و 41 سویه مقاوم در برابر آرسنیک 22 - سویه گرم مثبت و 19 سویه گرم منفی - معرفی کردند که بر اساس توالی ژن 16S rRNA شناسایی شدند. این سویه ها بین 22 جنس و پنج خانواده بزرگ باکتری Actinobacteria، Ȣ-Proteobacteria ، Firmicutes ، α-Proteobacteria، β-Proteobacteria توزیع شده بودند. [10]
▪ اسکالانت و هکارانش در سال 2009 باکتری مقاوم به آرسنیک از رودخانه ای با آلودگی آرسنیک در صحرای آتاکاما - شیلی - را جدا سازی کردند. این باکتری مقاوم به آرسنیک می تواند در حضور آرسنیت و آرسنات رشد کند.[11]
▪ قدوسی حدیث و هماکارانش در سال 2011 به بررسی باکتری های خاک آلوده به آرسنیک پرداختند. نتایج این مطالعه نشان داد که 69 و 25 درصد از سویه های مقاوم به آرسنیت به ترتیب باکتری های گرم مثبت و منفی بودند و 6 درصد از آنها کوکوس های گرم مثبت بودند. بالاترین مقاومت - - MCI به آرسنیت مربوط به باسیل گرم مثبت بود. حداکثر MIC و MBC آن به ترتیب 128 و 192 میلی گرم / لیتر مربوط به باکتری هایی مانند B. macerans، B. megaterim و C. vitarumen بود .[3]
▪ منوچهر چیت سازان و هکارانش در سال 2012 آلودگی مرتبط با شورابه های نفتی وحذف زیستی آرسنیک در چشمه های گرو منطقه مسجدسلیمان، استان خوزستان را بررسی کردند. در این مطالعه آلودگی آب به فلزات سنگین از جمله نیکل، وانادیم، آرسنیک و آهن ناشی از حضور شورابه ها در آب گرو نشان داده شده است. باکتری های احیاکننده سولفات و آهن به خوبی آرسنیک را از آب آلود جذب می کنند و قابلیت استفاده در عملیات رفع آلودگی آرسنیک از آب را دارند، همچنین مقدار جذب آهن نیز با حضور آرسنیک افزایش می یابد. [2]
▪ سانتوش کومارکارن و همکارانش در سال 2015 باکتری مقاوم به آرسنیت از معدن طلای سین کیانگ چین کشف کردند که قابلیت اکسایش بالا از As - III - به As - v - در خاک و تثبیت آرسنیک زیستی در دسترس را دارد. دارای مقاومت بالا نسبت به As - III - است و قادر به اکسیده شدن تا غلظت آرسنیک 6400 میلی گرم بر لیتر است. فعالیت آنزیم اکسیداز ارسنیت از این سویه ، سطح مقاومت آرسنیت بالا را نشان می -دهد . بر اساس تجزیه و تحلیل ژن 16SrRNAاین باکتری به Pseudomonas sp نزدیک است .[12]
مواد و روش کار :
-1 نمونه برداری از مناطق محتمل به وجود میکروارگانیسم های که جاذب یا مقاوم به فلز آرسنیک می باشد : نمونه برداری در شرایط استریل از عمق 20 سانتی متری خاک انجام شد ، پساب حاصل از تصفیه خانه ها در فلاکس آزمایشگاهی استریل ریخته و به آزمایشگاه منتقل شد.
-2 کشت در محیط اختصاصی حاوی آرسنات سدیم : با استفاده از محیط کشت لوریا برتانیٌ - - LB نمونه های مورد نظر طبق مراحل زیر کشت داده شد. - a کشت در محیط کشت مایع حاوی فلز آرسنات سدیم : یک گرم از نمونه خاک یا 1 سی سی از نمونه پساب مناطق نمونه بردای شده را در 10 سی سی از محیط کشت لوریا برتانی حاوی آرسنات سدیم ریخته و به مدت 3 رز در شیکر انکوباتور قرار داده شد. - b کشت در محیط کشت جامد : جهت جداسازی و شناسای باکتری ها ی مقاوم از مایه رویی نمونه های کشت داشته در محیط کشت مایع برداشته شد و بر روی محیط کشت لوریا برتانی اگار حاوی آرسنات سدیم کشت داده شد و در انکوباتور به مدت 48 ساعت گذاشته شد و در نهایت سویه های مقاوم جدا سازی شد.
-3 تعیین مقاومت یا جذب آرسنیک توسط سویه های جداسازی شده :
.a بدین منظور هر کدام از کلنی ها را که جداسازی شد در نوبت های جدا در محیط کشت LBA حاوی مقادیر مختلف آرسنات سدیم - 5000 -6000-7000 200000SSP - کشت داده شد و در نهایت کلنی های را که در بیشترین غلظت آرسنات سدیم - - 200000ppm رشد کردند جداسازی کرده و از بین چندین سویه جدا سازی شده از مناطق نمونه برداری 22 سویه در بیشترین غلظت آرسنات سدیم رشد داشتند.
