بخشی از مقاله
چکیده
طی بازدیدهای به عمل آمده در سال 1396 از مزارع و علفهای هرز حاشیه مزارع در شهرستان میناب، علایمی نظیرجارویی شدن و توقف رشد در برخی از کاهوی های وحشیLactuca virosa مشاهده شد. به همین منظور، پژوهش حاضر جهت مشخص شدن فیتوپلاسمای همراه بیماری انجام شد. از نمونه ها دی. ان. ای کل استخراج گردید و جهت بررسی آلودگی فیتوپلاسمایی آن ها، از روش PCR و جفت آغازگرهای عمومی P1/P7 - دور اول - و آغازگرهای آشیانه ای R16F2n/R16R2 - دور دوم - استفاده شد. محصولات تکثیری به صورت دو طرفه خوانش و توالی یابی شدند.
در تمام نمونههای دارای علایم، قطعاتی مورد انتظار تکثیر اما هیچ قطعهای در نمونه های گیاهان بدون علایم و کنترل منفی - آب مقطر به عنوان دی ان ای الگو - تکثیر نشد. جست و جو با برنامه بلاست، با استفاده از این ترادف، نشان داد که جاروک کاهوی وحشی بیشترین شباهت را به میزان 99 درصد با فیتوپلاسمای Alfalfa ZLWFKHVʼ EURRP SK\WRSODVPD - accession no. AY169323 - از گروه 16SrIIداشت.
بیماری جاروک کاهوی وحشی توسط Salehi et al. - 2007 - گزارش شده است که این محققین فیتوپلاسمای گروه 9 را عامل بیماری در استان فارس ذکر کرده اند. بر اساس اطلاعات حاضر، این اولین گزارش از وجود فیتوپلاسمای گروه دو همراه با این بیماری در ایران و شاید در جهان باشد. این علفهای هرز میتوانند به عنوان میزبان حدواسط برای بیماریهای مهم همچون بیماری جاروک لیموترش نقش داشته باشند.
مقدمه
فیتوپلاسماها عوامل همراه بیماریهای مختلف در گروههای متنوع و مهم گیاهی شامل گیاهان زراعی، سبزی و صیفی، درختان جنگلی و درختان میوه هستند.[4] آنها به دلیل نداشتن دیوارهی سلولی و احاطه شدن با غشای پلاسمایی دو لایه دارای شکلهای گوناگون - گرد و تخممرغی تا رشتههای منشعب و مارپیچی - میباشند. [5] فیتوپلاسماها در محیط- های با فشار اسمزی بالا فعالیت خوبی دارند، بنابراین آوند آبکشی گیاهان به دلیل غنی بودن از مواد قندی، مکان مناسبی جهت استقرار و تکثیر آنها محسوب میشود.[8]
گیاهان آلوده به فیتوپلاسما طیف وسیعی از علایم را نشان می دهند که بسیاری از آن ها با علایم ناشی از سایر بیمارگرهای گیاهی متفاوت است. استفاده از علایمی از قبیل گل سبزی، فیلودی و جاروک همراه با ریزبرگی از روش های مؤثر در تشخیص اولیه بیماری های فیتوپلاسمایی است.
فیتوپلاسماها محدود به آوند آبکشی گیاه میزبان بوده و در طبیعت اغلب توسط حشرات راستهی Hemiptera به شیوهی پایا و تکثیری منتقل میشوند. این بیمارگرها با سس، پیوند و اندامهای مخصوص تکثیر رویشی مانند قلمه، پا جوش، غده،
پیاز و ریزوم نیز قابل انتقال میباشند .[4]
گیاه Lettuce Wild با نام علمی Lactuca virosa در زبان فارسی کاهوی وحشی نامیده می شود و در زبان فرانسه به vireuse Laitueمعروف است. نام Lactuca از لغت لاتینی گرفته شده به معنای عصاره شیرآبه و Virosa به معنای سمی است .کاهوی وحشی گیاهی است علفی، دوساله که به صورت خودرو در مزارع و کنار جادهها و دامنههای سنگلاخی در نواحی جنوبی اروپا، فرانسه، شمال افریقا به ویژه الجزیره و بعضی نواحی آسیا و ایران میروید.
نواحی مختلف البرز، کندوان، گرگان، بجنورد، مازندران، دره هراز، آذربایجان، مغرب مرند، استان فارس: جنوب شرقی شیراز، لار، میناب، سیستان، خراسان، لرستان، همدان، کرمانشاه: طاق بستان، اطراف تهران، قزوین، سمنان، دامغان و کاشان محلهای رویش این گیاه در ایران هستند .[9] در بازدید هایی که از مزارع و و علف های هرز حاشیه مزارع شهرستان بندرعباس و میناب در سال 96 به عمل آمد، گیاهان کاهوی وحشی با علایم جاروئی شدن و کوچک شدکی برگ مشاهده شد که تقریباً میزان آلودگی 30-20 درصد بود.
بنابراین این حدس زده شد که این گیاهان آلوده به فیتوپلاسما باشندبیماری. فیتوپلاسمایی قبلاً از این گیاه گزارش شده است به- طوریکه گزارش کرد که فیتوپلاسمای همراه با بیماری در کاهوی وحشی در استان فارس متعلق به گروه ار ان ای ریبوزومی جاروک نخود کبوتر 16SrIX است. همچنین مشخص شده است که گیاهان در مناطق مختلف ممکن است با گونههای مختلف فیتوپلاسما آلوده شوند.[3] لذا این مطالعه جهت مشخص شدن فیتوپلاسمای همراه بیماری در استان هرمزگان انجام گرفت.
مواد و روش ها
در سالهای 1396 از مزارع کشت صیفی و سبزی شهرستان میناب و علفهای هرز اطراف مزرعه بازدید به عمل آمد و از گیاهان کاهوی وحشی با علائم ریز برگی و جاروک نمونه برداری شد. مقداری از بافت برگ نمونههای جمع آوری شده با درج مشخصات کامل در فریزر با دمای -20 درجه سلسیوس نگهداری شد و مقداری نیز برای استخراج دیانای از بافت گیاهی و انجام واکنش زنجیره ای پلی مراز مورد استفاده واقع گردید. محل و زمان جمعآوری گیاهان دارای علائم بیماریهای فیتوپلاسمایی ثبت شد.
برای این منظور، پس از شستشوی برگ های مورد نظر در آب مقطر استریل، 0/2 گرم از رگبرگ میانی با ازت مایع و در هاون چینی استریل پودر شده و هر نمونه در داخل یک ریز لوله 1/5 میکرولیتری استریل قرار داده شدند. پس از اضافه کردن 800 میکرولیتر بافر - CTAB - Cetyl trimethylammonium bromide، لوله ها چند بار وارونه و به مدت 30 دقیقه در دمای 60 درجه سلسیوس در داخل حمام آبگرم نگهداری شدند. سپس ریزلوله ها در دمای آزمایشگاه قرار داده شده و مقدار 100 میکرولیتر مخلوط کلروفرم - ایزوآمیل الکل - به نسبت حجمی 24 به - 1 به هر نمونه اضافه گردید.
پس از چند بار وارونه کردن، در 14000 دور در دقیقه به مدت 1 دقیقه در دمای چهار درجه ی سلسیوس سانتریفوژ شدند. برای رسوب دادن DNA کل، رونشین هر ریز لوله به یک ریز لوله استریل دیگر منتقل و پس از اضافه کردن 100 میکرولیتر ایزوپروپانول سرد -20 - درجهی سلسیوس - ، به مدت هشت دقیقه در دمای چهار درجهی سلسیوس در 16000 دور در دقیقه سانتریفوژ گردیدند.
سپس قسمت رویی دور ریخته شد و قسمت ته نشین با 300 میکرولیتر اتانول 70 درصد بوسیله سانتریفوژ به مدت سه دقیقه در 16000 دور در دقیقه شستشو گردید. پس از دور ریختن اتانول، ریزلوله ها به صورت وارونه در دمای آزمایشگاه روی دستمال کاغذی تمیز خشک شدند. DNA کل استخراج شده در 50 میکرولیتر آب دیونیزه استریل حل گردیده و برای استفاده به عنوان دی ان ای الگو در آزمون PCR در دمای -20 درجهی سلسیوس نگهداری شدند.
