مقاله شناسایی عامل شانکر باکتریایی هلو در استان آذربایجان شرقی

بخشی از مقاله

بیماری شانکر باکتریایی هستهداران با عامل Pseudomonas syringae pv. syringae - Pss - یکی از بیماریهای مهم درختان میوه هستهدار در ابران می باشد. طی بررسی که در سال 1394 در سطح باغهای هلو در استان آذربایحان شرقی انجام شد از درختان دارای علائم شانکر روی شاخه ها نمونه برداری و به آزمایشگاه منتقل گردید . از کشت نمونهها، باکتریهایی با کلنیهای کرم رنگ، محدب و لعابی روی محیط کشت آگار غذایی، جداسازی شد. جدایههای باکتری روی نهالهای هلو بیماریزا بودند و پس از دو هفته علائم شانکر رو سرشاخهها ظهور کرد. جدایه ها روی محیط KB تولید رنگدانه فلورسنت کردند.

همه جدایه ها گرم منفی، کاتالاز مثبت، اکسیداز منفی، لهانیدن ورقههای سیب زمینی و ایجاد فوق حساسیت روی شمعدانی مثبت بودند. بر اساس آزمونهای بیوشیمایی، فیزیولوژیکی و بیوشیمایی، جدایههای عامل شانکر باکتریایی هلو به عنوان Pseudomonas syringae pv. syringae شناسایی شدند. ژن مولد توکسین سرینگومایسین در جدایهها توسط جفت آغازگر B1/B2 تکثیر شد که نشان دهنده صحت شناسایی جدایه ها به عنوان Pss بر اساس ویژگی های فنوتیپی بودند.

.1 مقدمه

بیماری شانکر باکتریایی هسته داران در تمامی مناطق اصلی پرورش درختان میوه در دنیا شیوع دارد. این بیماری می تواند بخشهای مختلف یک درخت را تحت تاثیر قرار دهد. تشکیل شانکر به همراه ترشح صمغ باکتریایی از بارزترین علائم این بیماری به شمار میرود. نواحی آلوده اندکی فرو رفتهاند و رنگ پوست ناحیه آلوده در مقایسه با پوست سالم تیرهتر است. بافت پوست در ناحیه شانکر، به رنگ نارنجی روشن تا قهوهای تیره در میآید. معمولا رگههایی به رنگ قهوه ای تیره به داخل بافت سالم اطراف شانکر توسعه مییابد.

شانکرها اغلب در اواخر زمستان و اوایل بهار ظاهر میشوند و در بهار همزمان با فعال شدن مکانیسمهای گیاهی، ترشح صمغ از شانکرها آغاز میشود. ترشح صمغ در برخی شانکرها مشاهده نمیشود، این شانکرها معمولا نرمتر و آبدار هستند و پوست درخت در این ناحیه فرورفته میشود. هنگامی که شانکر به صورت حلقهای در اطراف تنه یا شاخه گسترش مییابد، برگهای ناحیه بالای شانکر به داخل پیچیده و آویزان میشوند و رنگ آنها سبز مایل به زرد و نهایتا زرد میشود. چند هفته پس از ظهور علائم، شاخه یا تمام قسمتهای بالای شانکر خشک میشود .[14]

علائم روی برگ به صورت لکههای آبسوخته به قطر 1 تا 3 میلیمتر دیده میشود. به تدریج با بالغ شدن برگها، نواحی آلوده خشک و شکننده میشوند و در نهایت بافت آلوده از بافت سالم جدا شده و میافتد و برگ حالت غربالی و پارگی پیدا میکند. باتوجه به اینکه استان آذربایجان شرقی یکی از مناطق مهم کشت درختان هسته داران به خصوص هلو می باشد و از آنجائیکه بیماری شانکر باکتریایی هر ساله خسارت فراوانی به این محصول وارد می سازد لذا هدف از این تحقیق جداسازی و شناسایی عامل بیماری شانکر هلو در این استان می باشد.

.2 تئوری و پیشینه تحقیق

بیماری شانکر باکتریایی توسط پاتوارهای مختلف Pseudomonas syringae ایجاد می شود. سه پاتوار P. syringae pv. syringae، P.syringae pv. morsprunorum و P. syringae pv. persicae روی هسته داران بیماریزا هستند .[4] به منظور تشخیص و شناسایی گونه و پاتووارهای سودوموناس از روشهای مختلفی استفاده میشود. از جمله این روشها می توان به آزمونهای بیوشیمیایی و تغذیه ای [9]، توانایی فعالیت هسته یخی، باکتریوفاژها[10]، الگوی اسیدهای چرب، الکتروفورز پروتئین [11] و روشهای مولکولی [12] اشاره کرد.

روشهای معمول آزمایشگاهی تشخیص پاتووارهایP. syringae بر مبنای روشهای فنوتیپی شامل آزمون های بیوشیمیایی و فیزیولوژیکی استوار است .[19] هر چند تفاوت اصلی پاتووارهای این گونه در دامنه میزبانی آنهاست، ولی تفاوتهای دیگری نیز دارند که جهت شناسایی و تشخیص آنها مفید هستند. بر اساس حضور یا عدم حضور آنزیمهای تجزیهکننده ماکرومولکولها، کاتابولیسم قندها، متابولیسم ترکیبات آروماتیک و کاتابولیسم آمینواسیدها، یک سری آزمونهای بیوشیمیایی و تغذیهای جهت تشخیص P. syringae و تفکیک پاتووارهای آن ارائه شده است.

از جمله آزمونهای متداول در تشخیص گونههای سودوموناس، آزمون گروه LOPAT است که در تشخیص P. syringae، P. cichorii و P. viridiflava از سودوموناسهای ساپروفیت همراه گیاهی مورد استفاده قرار میگیرد. آزمون LOPAT شامل :L تولید لوان روی محیط سوکروز، :O اکسیداز، :P لهانیدن سیب زمینی، :A آرژنین دیهیدرولاز و :T واکنش فوق حساسیت روی برگ توتون میباشد .[19]

آزمون سری :G - GATTa ذوب ژلاتین، :A هیدرولیز اسکولین، :T فعالیت تیروزیناز و :T استفاده از تارتارات - نیز برای تمایز P. syringae pv. syringae و P. syringae pv. morsprunorum از سایر پاتووارهای این گونه به کار میرود .[13] نتایج مطالعات سند و همکاران [15]، مبنایی برای مطالعات تشخیصی با استفاده از آزمونهای بیوشیمیایی است. این تحقیقات توسط پالرونی [13] در سال 1984 توسعه داده شد.

آزمونهای بیوشیمیایی انجام شده در بررسی اخیر در جهت تشخیص و تفکیک پاتووارهای گونه P. syringae مفید میباشند. از آنجایی که در این مطالعات تعداد کمی استرین به کار برده شده است، یانگ و تریکس [20] به منظور رفع این مشکل و دستیابی به آزمونهای معتبر بیوشیمیایی و تغذیهای، 395 استرین از 32 پاتووار گونه P.syringae را مورد مطالعه قرار دادند.

در این بررسی 36 آزمون بیوشیمیایی جهت تشخیص و تفکیک پاتووارهای مربوط به P. syringae مفید شناخته شد که شامل تولید رنگدانه فلورسنت روی محیط کشت KB، هیدرولیز اسکولین، هیدرولیز آربوتین، ذوب ژلاتین، فعالیت آنزیمهای پکتولیتیکی، تولید سرینگومایسین و استفاده از منابع کربنی نظیر آدونیتول، اریتریتول، اینوزیتول، مانیتول، دیسوربیتول، سوکروز و اسید آمینههای الهیستیدین، دی و الهموسرین، اللوسین، سارکوسین و نمکهای آلی شامل هیدروکسیبنزوات، بتاهیدروکسیبوتیرات، گلوتارات، دی-تارتارات، دی و الگلیسیرات، التارتارات، لاکتات، مالونات، دیکوئینات، سوکسینات، مزوتارتارات و ترکیبات آمونیومی بتائین، تریبوترین، کولین، تریاستین و تریگونلین میباشد.

اوتا و انگلیش [12] به منظور تفکیک 30 جدایه Pss به دست آمده از میزبانهای مختلف، آزمونهای بیماریزایی روی نهال هلو انجام دادند. نتایج نشان داد که تمام جدایهها شانکرهای مشابهی روی ساقه نهالهای هلو به وجود آوردند. چنگ و همکاران [6] نشان دادند که آزمونهای بیماریزایی نیز نمیتواند در تفکیک جدایههای Pss موثر باشد. لیتل و همکاران [11] در مطالعه مشابهی، آزمونهای بیماریزایی روی نهال هلو را در گلخانه به منظور تمایز بین جدایههای هستهدار و جدایههای به دست آمده از سایر میزبانها انجام دادند.

در ایران اولین بار بیماری شانکر باکتریایی روی درختان زردآلودر اصفهان گزارش و میزان خسارت ناشی از آن 22-50 درصد ذکر گردید .[1] عامل این بیماری روی درختان گیلاس در اطراف تهران پاتووار Pss تشخیص داده شد .[5] شمس بخش و رحیمیان [19] نشان دادند جدایه های درختان میوه هسته دار آلوده به شانکر در استان مازندران با مشخصات پاتوار Pss مطابقت دارد.

الهینیا و رحیمیان [7]، باکتری Pss را به عنوان عامل بیماری شانکر هسته داران در منطقه کلاردشت و حومه شناسایی و معرفی نمودند. محمودی و همکاران [2] باکتری Xanthomonas arboricola pv. pruni را به عنوان شانکردرختان هسته دار در استان گلستان شناسایی کردند. عباسی و همکاران [3] با استفاده از روش های فنوتیپی و ژنوتیپی باکتری عامل بیماری شانکر هسته داران در استان های گیلان و اردبیل را Pss معرفی کردند.

.3مواد و روش ها

در سال 1394 از برخی باغ های درختان هلو واقع در مناطق مخنلف استان آذربایجان شرقی بازدید و از درختان دارای علائم لکه برگی و شانکر باکتریایی نمونه هایی از بافت های آلوده، برگ، تنه، شاخه و سرشاخه جمع آوری شدند. نمونه ها در داخل پاکت های کاغذی قرار داده شده و به آزمایشگاه منتقل شدند و تا جداسازی عامل بیماری در دمای 4 درجه سیلسیوس در یخچال نگهداری شدند.

برای جداسازی باکتری، ابتدا برگ های دارای علائم لکه برگی و شاخه های دارای شانکر در زیر جریان آب شیر خوب شسته شدند و سپس به مدت 3 دقیقه در محلول هیپوکلریت سدیم قرار گرفتند و پس از شستشو با آب مقطر استریل، قطعاتی از برگ های دارای علائم و شانکر شاخه درون چند قطره آب مقطر استریل خرد شدند. پس از گذشت نیم ساعت، از سوسپانسیون حاصل روی محیط کشت نوترینت آگار دارای سوکروز کشت داده شدند. محیط کشت ها جهت رشد باکتری داخل انکوباتور در دمای 27 درجه سیلسیوس به مدت 2 روز نگهداری شدند.

بعد از گذشت این مدت زمان، کلنی های باکتری در داخل پتری ها ظاهر شده و تک کلنی های کرم رنگ تا نباتی رنگ انتخاب گردیده و به محیط کشت جدید منتقل شدند. به منظور اثبات بیماریزا بودن باکتری های جداشده، نهال های هلو سالم از نهالستان ها تهیه شدند و در داخل گلدان ها کاشته شده و در گلخانه نگهداری شدند. آزمون بیماریزایی به روش تزریق سوسپانسیون باکتری در شاخه های گیاهان انجام شد.

بدین منظور از کشت های 1 تا 2 روزه جدایه های باکتریایی، سوسپانسیونی با غلظت 107 سلول در هر میلی لیتر تهیه گردید. برای تلقیح، 10 میکرولیتر از سوسپانسیون حاصله به وسیله سرنگ انسولین به زیر پوست سرشاخه های جوان هلو تزریق شد. ظهور شانکرها یا زخم های فرور رفته بعد از گذشت حدود یک تا دو هفته نشانه مثبت بودن آزمون بیماریزایی تلقی می شود.

برای شناسایی جدایه ها، آزمون های اکسیداز، تولید لوان، فعالیت پکتولتیکی، آرژنین دهیدرولاز، فوق حساسیت روی توتون، هیدرولیز ژلاتین، اسکولین، نشاسته، رشد هوازی و بی هوازی، رشد در درصدهای مختلف نمک طعام و استفاده از منابع کربنی مخنلف به روش شاد و همکاران انجام شدند [16] به منظور شناسایی ژنوتیپی جدایه های عامل بیماری، استخراج DNA به روش لیز قلیایی انجام شد. پس از استخراج دی ان ای ژن تولید سیرینگومایسین جدایه ها، با استفاده از جفت آغازگر - B1 - 5 CTTTCCGTGGTCTTGATGAGG-3 - و - B2 - 5 -TCGATTTTGCCGTGATGAGTC-3 انجام شد. محصول PCR در ژل آگارز 1/5 درصد تحت ولتاژ 80 ولت به مدت یک ساعت الکتروفورز گردید.