بخشی از مقاله
چکیده
لیسیانتوس Eustoma grandiflorum از خانواده Gentianaceae است و در بیشتر نقاط دنیا کشت میشود. در این پژوهش براي اولین بار در دنیا، کشت میکروسپور گل لیسیانتوس انجام شد. در کشت میکروسپور به علت تعداد زیادي میکروسپور، بازیافت گیاهان هاپلوئید بسیار زیاد بوده و روشی است که اخیرا به علت مزایاي آن بر کشت بساك، مورد توجه قرار گرفته است.
به منظور استخراج و جداسازي میکروسپورها از بساك، در آزمایش اول از محیط جداسازي 13 در صد ساکارز و با pH=6 استفاده شد و در آزمایش دوم از محیط B5-13 با 13 در صد ساکارز و با pH=6 مورد استفاده قرار گرفت؛ که پاسخ محیط استخراج با B5-13 به آندروژنز بهتر بود. براي جداسازي میکروسپورها از سه روش خورد کرد با بلندر، له کردن با پیستون سورنگ و در نهایت از مگنت و گلسفایر استفاده شد؛ که آخرین روش، مناسبترین روش ارزیابی شد. دور و مدت زمان سانترفیوژ بر پایه بیشترین رسوب ایجاد شده و میزان میکروسپورهاي زنده مانده، تعیین گردد؛ بهترین زمان 5 دقیقه و دور 1400 rpm تعیین شد.
مقدمه
لیسیانتوس Eustoma grandiflorum از خانواده Gentianaceae، که در باغبانی به عنوان یک گل تزیینی گلدانی، فضاي آزاد و شاخه بریده در بیشتر نقاط دنیا کشت می شود؛ موطن اصلی آن مناطق مرکزي و جنوب آمریکا - دشت هاي نبراسکا، کلرادو و تگزاس - و مکزیک است، اما بیشتر در ژاپن توسعه پیدا کرده است و از اهمیت بالایی در بازارهاي جهانی برخوردار است
کشت میکروسپور، یکی از روش هاي تولید گیاهان هاپلوئید می باشد؛ این روش یکی از تکنیک هاي موثر و مطمئن براي تولید تعداد زیادي از گیاهان هموزایگوس به شمار می رود. پتانسیل تولید گیاهان هاپلوئید در کشت میکروسپور بالا بوده و تولید سریع لاین هاي خالص از میکروسپورهاي ایزوله، مهمترین ویژگی آن در برنامه هاي اصلاحی می باشد - اصلانی و همکاران . - 1384 در این روش بازیافت تعداد زیادي از گیاهان هاپلویئد به علت دارا بودن تعداد زیادي میکروسپور روشی است که اخیرا به علت مزایاي آن بر کشت بساك، مورد توجه قرار گرفته است
تولک نخستین دانشمندي بود که در سال 1953 مشاهده کرد که اگر دانه گرده رسیده گیاه Ginkgo biloba - از بازدانگان - را در محیط غذایی مناسبی کشت داد، می توان کالوس هاپلوئید تولید نمود. اولین گزارش قطعی از جنینزایی هاپلوئید حاصل از میکروسپور توسط گوها و مهسواري در سال 1964 منتشر شد. براي اولین بار کشت میکروسپور اطلسی در سال 1972 توسط بیندینگ انجام شد. تشکیل جنین هاپلوئید از میکروسپور کلزا براي اولین بار به وسیله ي لیشتر در سال 1982 گزارش گردید. تولید گیاهان هاپلوئید تنها به گونههاي زینتی محدودي محصور بوده است
در این پژوهش براي اولین بار در دنیا، کشت میکروسپور گل لیسیانتوس انجام شد و به نتایج امیدوار کننده اي در زمینه ي رسیدن به القاي آندروژنز در گل لیسیانتوس - که تنها گل با ارزش شاخه بریده اي است که با بذر تکثیر می گردد - دست یافتیم. همچنین در این پژوهش هاپلوئیدي در گیاهان باغبانی و مخصوصا گل ها براي اولین بار در ایران با روش کشت میکروسپور به عنوان مناسب ترین و پر عملکردترین روش موجود، که به عنوان جایگزینی براي سایر روش هاي اصلاحی سنتی در دنیا شناخته شده است، انجام شد. - لازم به ذکر است که تا به حال آندروژنز تنها از طریق کشت بساك در گیاهان باغی فقط در گل اطلسی، گل رز، توت فرنگی، انگور و گوجه فرنگی در ایران صورت گرفته است، که اکثر این موارد نتایج کاملا موفقیت آمیزي را در پی نداشته است - .
مواد و روش هاي تحقیق
مواد گیاهی مورد استفاده در این پژوهش از گلخانه اي در شهرستان پاکدشت تهیه شد. آزمون هاي سیتولوژیکی به منظور تشخیص بهترین مرحله ي تکامل دانه گرده - میکروسپوروژنز - و بهترین رابطه مرفولوژیکی با این مرحله در آزمایشگاه ژنتیک و سیتوژنتیک گروه باغبانی پردیس ابوریحان دانشگاه تهران انجام گردید. آزمایش هاي مربوط به کشت میکروسپور گل لیسیانتوس در آزمایشگاه کشت بافت و بیوتکنولوژي پردیس ابوریحان دانشگاه تهران انجام شد.
ضد عفونی و گندزدایی غنچه ها در زیر هود ایر لامینار فلو در داخل فالکون 50 میلی لیتري حاوي 30- 40 ml هیپوکلریت سدیم 3/5 درصد با تکان دادن انجام شد و پس از آن سه مرتبه با آب مقطر شستشو کردیم. لازم به ذکر است که به منظور از بین رفتن احتمال مرگ میکروسپورها، تمام محلول هاي گندزدایی، آب مقطر، محیط استخراج میکروسپور - جداسازي - و محیط کشت قبل از استفاده در یخچال 4°C نگهداري شد. گندزدایی وسایل و ظروف حاوي آب مقطر، محیط استخراج با دماي 121°C و فشار 2/1 بار در اتوکلاو انجام می شود؛ اما با توجه به حساس بودن بعضی ویتامین ها و اسید هاي آمینه به گرماي اتوکلاو، محیط با فیلتر سرسرنگی 0/2 میکرونی گندزدایی گردد.
به منظور استخراج و جداسازي میکروسپورها از بساك، در آزمایش اول از محیط جداسازي 13 در صد ساکارز و با pH=6 که مشابه روش فلتچر و همکاران است، استفاده شد و در آزمایش دوم از محیط B5-13 با 13 در صد ساکارز و با pH=6 مورد استفاده قرار گرفت
براي جداسازي - ایزوله کردن - میکروسپورها از سه روش استفاده کردیم. در آزمایش اول از بلندر - مخلوط کن - که محفظهي درون آن 48 ساعت در الکل 70 در صد گذاشته شده بود و کل آن زیر هود روشن الکل پاشی شده بود استفاده شد و محیط جداسازي و غنچه هاي گندزدایی شده درون مخلوط کن می ریزیم. در آزمایش دوم از پیستون سورنگ و یک بشر کوچک گندزدایی شده استفاده شد، که این روش در کلزا و گیاهان با غنچهي کوچک این روش کارآمد بوده است.
در جداسازي به این روش ابتدا غنچه هاي گندزدایی شده را به داخل فالکون 50 ml دیگري انتقال داده، سپس 30 ml محیط استخراج میکروسپور گندزدایی شده به آن اضافه کرده، پس از آن 3 ml از محیط استخراج میکروسپور و غنچه ها را داخل بشر کوچک گندزدایی شده ریختیم و به آرامی با ته پیستون سرنگ گندزدایی شده غنچه ها را کوبیده تا میکروسپورها در محیط استخراج آزاد شوند. در آزمایش سوم پس از جدا سازي بساك ها از غنچه ها با کمک پنس در شرایط گندزدایی شده، به کمک مگنتی که توسط هیتر استارر درون گلسفایر می گردید، میکروسپورها را از بساك ها، ایزوله و جدا شدند. درون هر گلسفایر حدود 15 بساك قرار دادیم.
سوسپانسیون حاصل را در شرایط کاملا گندزدایی شده از الک آزمایشگاهی 58 µm عبور داده و در ارلن گندزدایی شده قرار گرفت؛ سپس هر 30 ml از آن را در یک فالکون 50 ml ریخته و فالکون ها را در سانتریفیوژ قرار می دهیم. دور و مدت زمان سانترفیوژ پس از بررسی هایی که بر پایه بیشترین رسوب ایجاد شده و میزان میکروسپورهاي زنده مانده، تعیین گردد.
پس از سانترفیوژ روشناور - مایع زرد رنگ روي رسوب ته فالکون - را توسط سنپلر با سر سنپلر گندزدایی شده برداشته و پس از اضافه کردن مجدد محیط استخراج یک بار دیگر با همان دور و زمان سانترفیوژ شد، که این مرتبه نیز روشناور بالاي رسوب که روشنتر است را بر داشتیم. در ادامه 4- 5 ml محیط مایع NLN با 13 در صد ساکارز و pH=5/8 به رسوب میکروسپور ته فالکون اضافه کرده و چند بار به هم می زنیم تا سوسپانسیون کاملا یکنواخت گردد. 6 ml از محیط مایع NLN در پتري هاي 6 cm ریخته و پس از آن 200 µl از سوسپانسیون حاوي میکروسپور به پتري ها اضافه و هر پتري را با دو دور پارافیلم درزگیري کردیم.
ویژگی محیط کشت NLN داشتن منبع کربوهیدرات زیاد - ساکارز 13 در صد - می باشد که محیط اسمزي مناسب جهت مراحل القاي جنین را فراهم می کند؛ همچنین در این محیط کشت به دلیل آن که میکروسپورها خود یک منبع غنی از هورمون هاي رشد - اکسین و سایتوکینین - هستند نیازي به افزودن هورمون به محیط کشت NLN نیست - اصلانی و همکاران . - 1384 پس از اعمال پیش تیمار گرمایی در دماها و زمان هاي مناسب در تاریکی، پتري ها در دماي 25°C و شرایط تاریکی انکوبه شدند. تحول و تغییرات میکروسپورها پس از کشت با میکروسکوپ اینورت inversion - - microscope موجود در پژوهشکده بیوتکنولوژي کشاورزي مشاهده گردد.
نتایج و بحث
در کشت میکروسپور لیسیانتوس با هر دو محیط استخراج پاسخ مثبت دریافت شد؛ اما در کشت با محیط B5-13 با 13 در صد ساکارز و با pH=6 القاي آندروژنز مناسبتر بود و تعداد بیشتري از میکروسپورها به ساختار چند سلولی رسیدند
