بخشی از مقاله
بررسی بتالاکتامازهای وسیع الطیف تیپ TEM در ایزوله های اشرشیاکلی جدا شده از آبهای زیرزمینی استان آذربایجان شرقی به وسیله ی روشهای فنوتیپی و ژنوتیپی
چکیده
اشرشیاکلی علاوه بر اینکه به عنوان آلایندهی آب مطرح میباشد به عنوان شاخص آلودگی مدفوعی نیز حائز اهمیت بوده و حضور سویههایی از این باکتری که ساکن طبیعی رودهی انسان نمیباشد به عنوان خطری برای بروز انواع بیماریها قابل توجه است. علاوه بر حضور عوامل حدت در باکتری اشرشیاکلی پیدایش سویههای مقاوم به آنتی بیوتیکها به عنوان یکی از چالشها در درمان بیماریهای ناشی از سویههای مقاوم در این باکتری مطرح است. این باکتری قادر به تولید بتالاکتامازهای وسیعالطیف (Extended spectrum beta lactamases,ESBLs) بوده و این آنزیمها باعث مقاوم شدن باکتری در برابر آنتیبیوتیکهای بتالاکتام میشود. استفاده از پرایمرهای یونیورسال به منظور شناسایی کامل این باکتری شاخص آب میتواند در مطالعهی پراکندگی مقاومت این باکتری مفید واقع شود. تولید آنزیم بتالاکتاماز در باکتری اشرشیاکلی مشکلات فراوانی را در در پروسهی درمانی بیماریها ایجاد کرده است و ژن TEM یکی از عوامل مقاومت کلیفرمی از نظر تولید بتالاکتامازهای وسیع الطیف به روشهای فنوتیپی و ژنوتیپی برای شناسایی ژنهای TEM مورد بررسی قرار گرفتند. در این مطالعه جهت تعیین ESBLs به روش فنوتیپی از آنتی بیوتیکهای سفتازیدیم، سفتازیدیم کلاولانیک اسید و سفوتاکسیم، سفوتاکسیم کلاولانیک اسید استفاده شده است. و همچنین از سویهی E. coli ATCC 35218 به عنوان کنترل مثبت ژن blaTEM استفاده شد و با استفاده از روش PCR ژن blaTEM د ر هر یک از ایزولهها شناسایی شد. در این مطالعه نتایج فنوتیپی تنها %9 حضور ESBLs را تایید نمود این درحالی است که در بررسی ژنوتیپی %39 از سویههای مورد مطالعه درای ژن blaTEM بودند که از این تعداد %44 متعلق به چشمهها .و %56 مربوط به قناتها میشد. باتوجه به این که اکثریت غالب باکتریهای اشرشیاکلی شناسایی شده درای مقاومت بتالاکتامازی TEM میباشند لذا کنترل و نظارت بهداشتی در آب حاصل از قناتها و چشمهها ضروری به نظر میرسد.
واژههای کلیدی: اشرشیاکلی، آبهای زیرزمینی، پی سی آر، ESBL، TEM، بتالاکتاماز
-1 مقدمه
در ایران وقوع خشکسالی، رشد روز افزون جمعیت و افزایش نیاز به منابع آبی، بحران آب را در سالهای اخیر تشدید نموده است و ازطرفی منابع آب شیرین موجود نیز در معرض آلودگیهای گوناگون است. به طور کلی ورود مستقیم و غیر مستقیم مواد آلاینده از منابع طبیعی و مصنوعی به منابع آبی به عنوان پذیرندهی سطحی و زیرزمینی موجب بروز تغییرات نامطلوب در کیفیت این منابع میشود. لذا جلوگیری از گسترش آلودگی حفاظت کیفی آبهای سطحی و زیرزمینی موجود در کشور حائز اهمیت است . کیفیت آب به طور کلی در سه بعد فیزیکی، شیمیایی و میکروبی بررسی میشود و منشاء اصلی آلودگیهای میکروبی آب عموماً انسانی و فضولات حیوانی است. در بررسی میکروبی، حضور اشرشیاکلی درآب آشامیدنی نشانهای از آلودگی مدفوعی بوده و شاخص قابل اطمینان از آلودگی مدفوعی آب است و خطر ابتلا به بیماریهای منتقله از راهآب نشان را میدهد Souza 1999) ، .(Chiueh 2001 این باکتری عضو خانواده انتروباکتریاسه و یکی از شایعترین عوامل باکتریایی جدا شده از عفونتهای انسانی است. بسیاری از سویه-های اشرشیاکلی حدت پایینی دارند اما میتوانند بهصورت فرصتطلبانه در خارج از دستگاه گوارش موجب بروز بیماریهای دستگاه ادراری و غدد پستانی گردند و در عفونتهای زخم، پنومونی، مننژیت و سپتیسمی شرکت کنند. همچنین برخی از سویه-های اشرشیاکلی موجب تنوع بیماریهای گوارشی و خارج رودهای میشوند Matthew 2013) ،آواک .(3383 درمیان جمعیتهای اشرشیاکلیکه احتمالاً بیشتر شامل دستجات بیماریزای آن میباشد مقاومتهای آنتیبیوتیکی شایع بوده و در اثر استفاده بیرویه از آنتیبیوتیکها در این باکتریها رو به افزایش است Denton 2007) و.( Pitout 2008 مکانیسمهای مقاومت باکتریایی در برابر آنتی بیوتیکها مختلف هستند و یکی از این مکانیسمها تولید آنزیمهای بتالاکتامازی در باکتریهاست. بتالاکتامازها مهمترین و وسیعترین آنزیمهای تخریب کنندهای هستند که به آنتی بیوتیکهای بتالاکتام حملهور شده و باکتری را در برابر آنتیبیوتیکهای بتالاکتام حفاظت میکنند . این آنزیمها از طریق اتصال آسیل کوالانت به گروه کربوکسیل حلقهی بتالاکتام و شکستن آن باعث غیر فعال شدن دارو میشوند .(Joklik1992) بتالاکتامازهای وسیعالطیف ESBL از بتالاکتامازهای کلاس A بوده که سفالوسپورینهای وسیعالطیف با یک زنجیر جانبی اکسیمینو (Oximino) را هیدرولیز میکنند و باعث بروز مقاومت باکتریایی به پنی سیلینها، سفالوسپورینهای نسل اول، نسل دوم، نسل سوم و آزترئونام به جز سفامایسینها یا کارباپنم به وسیله هیدرولیز این آنتی بیوتیکها را دارند و توسط مهارکنندههای بتالاکتاماز مانند کلاولانیک اسید مهار میشوند(.(Knothe 1983 امروزه تعداد ارگانیسمهایی که قادر به تولید ESBL هستند در حال افزایش هستند. اشریشیاکلی یکی از باکتریهایی است که قادر به تولید آنزیمهای بتالاکتاماز وسیعالطیف میباشدبتالاکتامازهای. وسیع الطیف اکثراً در گونههای اشرشیاکلی و کلبسیلا پنومونیه مشاهده میشوند Al- 2008) .(Zarouni بتالاکتامازهای وسیع الطیف انواع مختلفی دارند که از آن جمله می توان به آنزیمهای TEM اشاره کرد ژنهای تولید کنندهی آنزیم blaTEM برروی پلاسمید قرار دارند و انتقال آن به وسیلهی پلاسمید تسهیل میشود. این آنزیمها محدودهی طیف اثر
وسیعی برروی پنی سیلینها و سفالوسپورینها دارند. و آنزیم بتالاکتاماز TEM یکی از مهمترین بتالاکتامازی و از علل مقاومت چنددارویی در عفونتهای بیمارستانی محسوب میشود Mocktar 2007) و.(Jacoby 2005 در واقع بروز جهشهای نقطهای در سکانس اسیدآمینهای بتالاکتامازهای اولیه نظیرTEM-1، TEM-2 باعث پیدایش آنزیمهای جدید و وسیع الطیف شده است که امروزه تحت عنوانESBLs مطرح است عفونتهای ایجاد شده توسط ESBL از عفونتهای جزیی مانند عفونتها دستگاه ادارای تا عفونتهای شدیدتر مانند ذاتالریه متغیر است و حضورآنزیمهای ESBL در محیطزیست در شمار خطرات بالقوه شیوع عفونت در انسان است. زبالههای خانگی و بیمارستانی و کشاورزی میتوانند منشأ باکتریهای مولد ESBL بیماریزا باشند .(Shehani 2013) بررسی باکتری اشرشیاکلی جدا شده از آبهای زیرزمینی از نظر تولید بتالاکتامازهای وسیع الطیف که به عنوان بزرگترین فاکتور خطر در مخاطرات بهداشت عمومی است هدف این مطالعه میباشد. بدین منظور میزان تولید بتالاکتامازهای وسیعالطیف از لحاظ فنوتیپی مورد بررسی قرار گرفت و در ادامه فراوانی ژنهای بتالاکتاماز تیپ TEM که از ژنهای بتالاکتامازی شایع دراشرشیاکلیها است مورد ارزیابی قرار گرفت.
-2 مواد و روشها
-1 -2 ایزولههای اشرشیاکلی
تعداد57 نمونه مثبت لاکتوز حاصل از آزمایشات MPN چشمهها و قناتها از آزمایشگاه میکروبیولوژی اخذ گردید. و با مجموعه آزمایشات بیوشیمیایی اشرشیاکلیهای شناسایی شده و بر روی پلیت محیط کشت BHI تک کلنی خالصشده بهصورت خطی کشت داده شد. ایزولههای به دست آمده جهت انجام آزمایشات و تجزیه و تحلیل PCR در گلیسرول %33 در دمای -73°c نگهداری شد.
-2 -2 مطالعه ی فنوتیپی باکتری اشرشیاکلی ازنظر مقاوم :ESBLs
هدف از انجام این آزمون جداسازی سویههای تولید کنندهی ESBLs بود. جهت بررسی حضور باکتریهای وسیعالطیف ESBLsدر سویههای جداشده مقاوم به سفتازیدیم به روش دیسک ترکیبی، دیسک سفتازیدیم (33µg) و دیسک ترکیبی سفتازیدیم کلاولانیک اسید (33+33) µg سفوتاکسیم (33µg) و دیسک ترکیبی سفوتاکسیم کلاولانیک اسید (33+33)µg تهیه شده از شرکت روسکوی دانمارک مورد بررسی قرار گرفتند. در این آزمون، سوسپانسیونی معادل نیم مکفارلند ازتمامی ایزولهها تهیه و بهوسیله سواپ پنبه دار در محیط کشت مولر هینتون آگارکشت داده شد. دیسکهای سفوتاکسیم و سفوتاکسیم کلاولانیک اسید و سفتازیدیم و سفتازیدیم کلاولانیک اسید به فاصله 2/5 سانتیمتر (مرکز به مرکز) بر روی محیط کشت قرار داده شد و به مدت 36-23 ساعت در دمای 37 درجه انکوبه گردید. هالههای عدم رشد اندازهگیری شد. ایزولههایی که دارای اختلاف قطر هالهی عدم رشد پنج میلی متر و یا بیشتر در اطراف دیسکهای سفوتاکسیم و سفوتاکسیم کلاولانیک اسید و یا سفتازیدیم و سفتازیدیم کلاولانیک اسید هستند با استفاده از دستورالعمل CLSI بهعنوان باکتریهای تولیدکننده ESBL مشخص میشوند 2013)
.(Franklin
-3 -2 شناسایی ژن های بتالاکتامازی blaTEM
پس از استخراج rRNA در شرایط استریل برای شناسایی ژن های بتالاکتامازی از پرایمری با طول 833 جفت باز با مشخصاتی مطابق جدول(PCR (3 به عمل آمد .(Dallenne 2010) همچنین از سویههای E. coli ATCC 35218 به عنوان کنترل مثبت ژن blaTEM استفاده شد. از ژل آگارز %2 و مارکر 333جفت بازی برای الکتروفورز محصولات PCR استفاده شد.
-3 نتایج
-1 -3 مطالعه ی فنوتیپی باکتری اشرشیاکلی ازنظر مقاومت ESBLs
