بخشی از مقاله
چکیده
خرما - Phoenix dactylifera L - یکی از مهمترین درختانی است که از گذشته دور توسط انسان کشت شده و ارزش بالاي غذایی، اقتصادي و اجتماعی خرما اکنون به خوبی شناخته شده است. ایران یکی از عمده ترین تولیدکنندگان خرماي جهان میباشد و حدود 2درصد از کل مساحت زمینهاي زراعی کشور زیر کشت درخت خرما می باشد. براي حفظ ژرم پلاسم و تنوع ژنتیکی موجود در خرماي کشور شناسایی نشانگرهاي اختصاصی براي آن بسیار ارزشمند میباشد.
در این مطالعه نشانگر ریزماهواره از خرما با استفاده از روش فیاسکو شناسایی و جداسازي شد. تنوع ژنتیکی نشانگرهاي جداسازي شده در 50 ژنوتیپ خرما مورد بررسی قرار گرفت. تعداد آلل مشاهده شده در این نشانگرها 2 تا 4، با میانگین 2.5 آلل در هر جایگاه می باشد. هتروزایگوسیتی مشاهده شده و مورد انتظار به ترتیب 0.11-1 و 0.74-0.10 میباشند. میانگین PIC مشاهده شده 0.38 میباشد. نشانگرهاي جداسازي شده میتوانند منبع با ارزش و مفیدي براي بررسی تنوع ژنتیکی و ساختارهاي جمعیتی در خرما باشند.
مقدمه
خرما با نام علمی Phoenix dactylifera L. یکی از مهمترین گیاهان در مناطق خشک و نیمه خشک میباشد که که در پایداري اکوسیستم این منطقه اهمیت دارد. خرما متعلق به خانواده Aracaceae میباشد و در خاورمیانه، کشورهاي حاشیه مدیترانه، مرکز افریقا، غرب آسیا و استرالیا و آمریکاي شمالی وجود دارد . - 7 - ایران دومین تولیدکننده خرما در دنیا در 2008 میباشد. تولید سالانه خرما به 7.2 میلیون تن است که ایران بر اساس گزارش FAO 2008 بیش از یک ملیون تن خرما تولید میکند.
به دلیل اهمیت خرما در مناطق خشک، نگهداري و حفاظت و استفاده از ژرمپلاست و تنوع ژنتیکی آن در سطح مولکولی - DNA - ، به عنوان ابزاري براي جلوگیري از فرسایش ژنتیکی و نیز پیشرفت برنامههاي اصلاحی توصیه شده است . - 4 - اکثرمارکرهاي مولکولی به ویژه مارکرهاي بر اساس DNA بسیار کارا میباشند زیرا تحت تاثیر شرایط محیطی و نیز مراحل رشد و سن گیاه قرار نمیگیرند و نیز میتوانند اطلاعات دقیقی در مورد تنوع ژنتیکی گیاهان در اختیار ما قرار دهند.
ریزماهوارهها یا SSR نشانگرهاي اختصاصی، تکرارپذیرو همبارز براي مطالعه تنوع ژنتیکی میباشند . - 6 - تا کنون تنها تعداد اندکی نشانگر ریزماهواره خرما شناسایی شده است که توسط بیلوتی و همکاران در 16 - 2004 نشانگر - اکاك و همکاران در 17 - 2009 نشانگر - وهاموي و همکاران در 19 - 2010 نشانگر - گزارش شده است. براي حفظ ذخایر ژنتیکی این گیاه مهم، شناسایی و جداسازي نشانگرهاي بیشتر در سطح ژنوم خرما مورد نیاز است. در این مطالعه 9 نشانگر ریزماهواره جدید شناسایی و جداسازي شده است که این نشانگرها منبع با ارزش و متنوعی براي مطالعات تنوع ژنتیکی و بررسی ساختارهاي جمعیتی در خرما فراهم میکنند.
مواد و روشها
به منظورشناسایی وجداسازي ریزماهواره بااستفاده از روش فیاسکو - 10 - 1 رقم خرماي پیارم انتخاب شد. براي ساختن کتابخانه ژنومی پیارم با تکرارهاي دونوکلئوتیدي و سه نوکلئوتیدي، میزان 250 نانوگرم از DNA ژنومی از برگهاي جوان P.
dactylifera L. بوسیله کیت کیاژن استخراج شد. هضم DNA بااستفاده ازآنزیم Tru 9I در دماي 37 درجه انجام شد. قطعات حاصل از تکثیر به سازگارساز - Mse I - مناسب آنزیم برشی متصل شدند. دو مرحله تکثیر قطعات حاصل از هضم آنزیمی با استفاده از آغازگر اختصاصی متناسب با توالی سازگارساز انجام شد. بررسی صحت تکثیر قطعات با استفاده از الکتروفورز محصول واکنش در ژل پلی اکریل آمیدواسرشته ساز شش درصد انجام شد.
جداسازي قطعات تکثیر شده حاوي توالیهاي تکراردار با استفاده از کاوشگرهاي دو و سه نوکلئوتیدي - ATT - 10}، - CTT - 10 ، - GTG - 10، - GC - 17، - AC - 17، - CT - 17،و { - AT - 17 که بوسیله بایوتین نشاندار شدهاند، انجام شد. هیبرید حاصل از کاوشگر و قطعات DNA بوسیله استراپتویدین در محیط مغناطیسی جداسازي شد. براي جدا کردن اتصالات غیر اختصاصی 3 مرتبه شستشوي دقیق ضعیف بوسیله - TEN 1000, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 1 M NaCl - و 3 مرتبه شستشوي دقیق قوي بوسیله[0.2X SSC and 0.1% w/v SDS] انجام شد، سپسDNA تک رشته اي از قطعات استراپتوآویدین جداسازي شد و در نهایت قطعاتDNA تک رشتهاي بدست آمده در مراحل قبل، بوسیله واکنش زنجیرهاي پلی مرازي تکثیر شدند.
قطعات حاصل از واکنش PCR با استفاده از کیت pGEM-T easy Cloning همسانه سازي شده و به باکتري E.coli - DH5α - انتقال داده شد. با استفاده از روشBlue white selection باکتريهاي کلون مثبت انتخاب شده و سپس به روش انهدام قلیایی پلاسمید آنها استخراج شد.پس از تاٌیید صحت همسانه سازي، استخراج پلاسمید با استفاده از کیت Core-Bio Plasmid Extraction - Korea - از باکتريهاي انتخاب شده انجام شد و پلاسمیدها جهت توالی یابی ارسال شدند. طراحی آغازگرها از توالیهاي بدست امده با استفاده از نرم افزار، از توالی نوکلئوتیدي دوطرف توالیهاي تکراردار انجام شد.
بمنظور بررسی پاراترهاي آماري از آغازگرهاي - نشانگرها - طراحی شده و تعیین کارایی آنها جهت تعیین میزان تنوع، 50 رقم مختلف خرما از کلکسیون خرماي اهواز انتخاب شد. استخراج DNA انجام شد و جهت تعیین مناسب ترین دماي الحاق آغازگرها به قطعات همتا در ژنوم، واکنشهاي زنجیرهاي پلی مرازي مختلفی طراحی وانجام شد و بهترین شرایط PCR براي هر نشانگر بدست آمد. تفکیک قطعات تکثیر شده با بهره گیري از ژل پلی اکریل آمید واسرشته ساز شش درصد انجام شد. قطعات DNA تکثیر شده به صورت صفر و یک - یک براي وجود و صفر براي عدم وجود نوار - DNA امتیاز دهی شدند. تجزیه آماري دادههاي حاصله با استفاده از نرم افزار [8] POPGENE 32 و [5] CERVUS 2.0 انجام شد.
نتایج و بحث
نتایج توالی یابی نشان داد که توالی CT در گیاه خرما نسبتا فراوانتر است - جدول - 1 و براي جداسازي سایر نشانگرهاي ریزماهواره از این گیاه مناسب میباشد. اکاك و همکاران در 2009 نتایج مشابهی را گزارش کردند در حالیکه هاموي و همکاران توالی GT را به عنوان توالی فراوانتر در خرما گزارش کردهاند. بیلوتی و همکاران در 2004تنها از GT براي تولید کتابخانه ژنومی خرما استفاده کردند و در بین 25 توالی انتخاب شده - 64% - 16 شامل توالیهاي تکراردار GA بودند. 42 کلون در این مطالعه توالی یابی شد که از میان آنها 13 کلون داراي یک یا تعداد بیشتري ریزماهواره بودند . - 30% -
جدول.1 خصوصیات 9 نشانگر چند شکل ریزماهواره در خرما Ho . - Phoenix dactylifera L. - هتروزیگوت مشاهده شده، He هتروزیگوت موردانتظار،PIC میزان پلی مورفیسم یک نشانگر، * نشانگرهایی که انحراف معنی داري با قانون هاردي –واینبرگ نشان دادهاند، Accition no شماره ثبت توالی نشانگر در پایگاه اطلاعاتی GenBank از این 13 توالی، 9 توالی در میان 50 نمونه بررسی شده، چندشکلی نشان دادند، در حالیکه باقی آنها یا همشکل بودند و یا الگوي نامشخص باندي نشان داشتند
