بخشی از مقاله
چکیده
زمینه و هدف :استافیلوکوکوس اورئو س یکی از مهمترین عوامل مسمومیت در مواد غذ ایی و لبنی است.
انتروتوکسین هاي استافیلوکوکی فاکتور اصلی ایجاد مسمومیت غذایی می باشد که از تیپ هاي مختلفی تشکیل شده اند. مهمترین آنها انتروتوکسین هاي تیپ A و تیپ B میباشد که در مسمومیت هاي غذایی درگیر میباشند. هدف از این مطالعه تشخیص ملکولی استافیلوکوکوس اورئوس بوسیله ژن nuc و بررسی فراوانی ژنهاي entA وentB در ایزوله هاي جدا شده از منابع شیر خام بوسیله Multiplex PCR می باشد.
روش بررسی: در این تحقیق توصیفی- تحلیلی ضمن رعایت شرایط استریل تعداد 140 نمونه شیر خام از خانوارها وگاوداریهاي سطح استان کهگیلویه وبویر احمد جمع آوري و سپس به آزمایشگاه منتقل شد.
نمونه ها با استفاده از روشهاي متداول باکتري شناسی کشت و استافیلوکوکوس اورئوس ها جداسازي شدند. ژنهاي nuc,sea,seb به روش Multiplex PCR شناسایی شدند.
یافته ها:با استفاده از روشهاي متداول باکتري شناسی %43/92 از نمونه ها از نظر وجود استافیلوکوکوس اورئوس مثبت بودند ولی به روش مولکولی %37/44از از نمونه ها داراي ژن - - nuc نوکلئاز مقاوم به حرارات بوده اند.
از مقدار نمونه هاي مثبت به روش مولکولی % 57/9 داراي ژن sea و %5/79 داراي ژن seb که از این مقدار %3/86 داراي هر دو ژن seaوseb بوده وseb %1/93 به تنهایی بوده است. مقدار نمونه هایی که فاقد ژن nuc بوده اند واجد هیچکدام ازدیگر ژنهاي مورد مطالعه نبوده اند.
نتیجه گیري: بر اساس یافته ها Multiplex PCR میتواند روش مناسبی براي شناسایی همزمان باکتري وشناسایی ژنهاي تولید کننده انتروتوکسین استافیلوکوکوس اورئوس با حساسیت و سرعت بالا باشد.
مقدمه:
باکتري استافیلوکوکوس اورئوس یکی از عوامل فرصت طلبی است که در شرایط مساعد قادر به ایجاد عفونت در انسان و حیوان میباشد. عوامل بیماریزاي فراوانی توسط این باکتري تولید میشود. برخی از گونه ها براي انسان و حیوان بیماري زا هستند و برخی دیگر در فساد مواد غذایی نقش دارند
استافیلوکوکوس اورئوس از جمله گونه هاي شاخصی است که علاوه بر بیماریزایی براي انسان در فساد مواد غذایی نیز نقش دارد و یکی از چهار عامل شایع و مهم در ایجاد مسمومیت غذایی می باشد.
امروزه استفاده از تکنیک هاي شناسایی باکتریها به روش مولکولی و حساسیت بالاي این روشها موجب شد تا در مدت زمان کوتاهی باکتري مورد نظر شناسایی شود
انتروتوکسین هاي استافیلوکوکوس اورئوس بر مبناي خصوصیات بیولوژیکی و سرولوژیکی به 18سروتیپ A تاU - بجز - F,S,R طبقه بندي شده اند
انتروتوکسین هاي استافیلوکوکی پروتئین هایی با وزن مولکولی 26-29 کیلو دالتون هستند که بوسیله استافیلوکوك کواگولاز مثبت تولید میشوند
از نظر مقاومت به شرایط فیزیکی و شیمیایی تقرباًی تمام سروتیپ هاي انتروتوکسین در مقابل حرارت و عوامل آنزیمی از جمله تریپسین موجود در دستگاه گوارش مقاومند. سروتیپ هاي SEA,SEB از عوامل اصلی گاستر وانتریت میباشند ضمن اینکه SEB میتواند در ایجاد بیماریهاي ریوي نقش داشته باشد.SEA مسئول بیش از %50 کل مسمومیت هاي غذایی میباشد، در ایالات متحده آمریکا SEA,SEB مسئول بیش از 69درصد مسمومیت هاي غذایی میباشند
بدلیل مقاومت انتروتوکسین به حرارت امکان ایجاد مسمومیت غذایی بعد از حرارت دهی نیز وجود دارد زیرا توکسین فعال باقی مانده و منجر به گاستروانتریت میگردد. در میان انتروتوکسینهاي باکتریایی SEB از اهمیت بیشتري برخوردار است .این توکسین مثل سایر سروتیپ ها از طریق گوارشی جذب می شود و گاستریت ایجاد میکند، ولی بر خلاف سایرین از طریق تنفسی و به صورت آئروسل هم قابل انتقال است - . - 5,6 هدف از این مطالعه شناسایی استافیلوکوکوس اورئوس به روش مولکولی وبررسی فراوانی ژنهاي انتروتوکسین SEA,SEB با روش Multiplex PCR بوده است.
مواد و روش بررسی:
در این مطالعه توصیفی - تحلیلی تعداد 140 نمونه شیر خام از مناطق مختلف استان کهگیلویه و بویراحمد تحت شرایط استریل جمع آوري و به آزمایشگاه منتقل گردید. مقدار 10 میلی لیتر از هرکدام از نمونه ها به محیط کوك میت براث - مرك - با غلظت دوبل در لوله در پیچ دار اضافه و به مدت 48 ساعت دردماي 37 درجه سانتیگراد انکوبه گذاري گردید. سپس /1 میلی لیتر از این محیط بر روي محیط برد پارکر - - Berd parker از شرکت مرك کشت و به مدت 24-48 ساعت انکوبه گذاري گردید. در نمونه هایی که باکتري رشد کرده بود، کلنی هاي سیاه رنگ با هاله شفاف در محیط برد پارکر به محیط کشت مانیتول سالت آگار، DNase ،تست vp ، انتقال شد و تشخیص گونه استافیلوکوکوس اورئوس قطعی گردید ضمن اینکه تستهاي کوآگولاز، کاتالاز و لام مستقیم هم انجام شد.
آنزیم DNA پلیمراز Taq ،آنزیم هاي با اثر محدود و نشانگر DNA ladder ، مواد;dNTP ;EDTA ;Tris-base کلرید منیزیوم، از شرکت سیناژن تهیه گردید و باکتري استاف اورئوس - ATCC=25923 - از انستیتو پاستور جهت کنترل مثبت تهیه گردید.
پرایمرهاي مورد استفاده: با استفاده از توالی پرایمرهاي طراحی شده سه جفت پرایمر براي ژنهاي دزوکسی ریبو نوکلئاز - nuc - که شاخصی براي شناسایی استافیلوکوکوس اورئوس میباشد و انتروتوکسین هاي A,B از شرکت سیناژن تهیه گردید
جدول :1 توالی پرایمرهاي آنزیم دزوکسی ریبونوکلئاز و انتروتوکسین هاي A,Bاستاف اورئوس
تخلیص ژنوم: استخراج ژنوم باکتریها به روش بویلینگ انجام شده و جهت بررسی کیفیت محصول استخراج شده ، DNAژنومی روي ژل آگاروز 1 درصد الکتروفورز شد. براي اندازه گیري غلظت DNA نیز از دستگاه اسپکتروفتومتر UV استفاده گردید. - 280-260 نانومتر - پس از آن واکنش Multiplex PCR انجام شد.
نتایج
در این تحقیق 140 نمونه شیر خام مورد بررسی قرار گرفت که 61 نمونه - %43/57 - استافیلوکوکوس اورئوس با استفاده از روشهاي بیوشیمیایی شناسایی شدند. سپس نسبت به استخراج DNA وآزمایش Multiplex PCR با استفاده از پرایمر هاي تهیه شده اقدام گردید.
براي شناسایی استافیلوکوکوس اورئوس هاي انتروتوکسیژنیک تایپ هاي A,B واکنش Multiplex PCR با سه جفت پرایمر ویژه ژنهاي seb,sea,nuc انجام شد که وجود قطعه 328 جفت بازي مربوط به تکثیر بخشی از ژن nuc ، نشان دهنده وجود این ژن در باکتري استافیلوکوکوس اورئوس بود که در 52 نمونه - - %37/14مثبت بوده و در 9 نمونه - %6/42 - تکثیر این قطعه مشاهده نگردید و از این طریق نسبت به شناسایی مولکولی این باکتري اقدام گردید.
وجود قطعه 181 جفت بازي در 30نمونه - - %57/69مربوط به تکثیر بخشی از ژنsea بود که نشان دهنده ژن کد کننده انتروتوکسین تایپ A در سویه هاي جدا شده میباشد. قطعه 267 جفت بازي مربوط به تکثیر بخشی از ژن seb بوده که در 3 نمونه - - %5/77 مشاهده شده است. نمونه هایی که فاقد ژن nuc بوده اند واجد هیچکدام از ژنهاي seb,sea نیز نبوده اند.2 نمونه داراي هردو ژن seb,sea بوده اند.
