بخشی از مقاله
چکیده
فرآوري آبزیان دریایی و پرورشی باعث تولید میزان زیادي فرآورده جانبی می شوند که یکی از آن ها غضروف می باشد. حضور منحصر بفرد هیدروکسی پرولین در پروتئین کلاژن، سبب شده که این ترکیب به عنوان شاخصی جهت اندازه گیري میزان کلاژن به کار رود. در این روش از هیدرولیز اسیدي یا قلیایی پودر غضروف جهت ایجاد فرم آزاد هیدروکسی پرولین و سپس با ایجاد یک مشتق رنگی و سنجش آن استفاده شد. میزان جذب محصول رنگی توسط اسپکتروفوتومتر در طول موج 543 نانومتر قرائت گردید. به دلیل میزان مناسب کلاژن در غضروف می توان از غضروف ماهی خاویاري به عنوان منبع جدید کلاژن استفاده کرد و بدین ترتیب به منافع تجاري و مدیریت زیست محیطی دست یافت.
.1 مقدمه
جانوران دریایی منبع غنی از مواد مغذي براي مصرف انسانی هستند، تولید و فرآوري آبزیان دریایی و پرورشی باعث تولید میزان زیادي فرآورده جانبی می شوند. این محصولات جانبی می توانند به عنوان یک منبع غنی از مولکولهاي زیستی متنوع که اثرات مفیدي بر سلامتی دارند مورد استفاده قرار گیرند .[1] غضروف به عنوان یکی از محصولات جانبی - زیرفرآورده - صنایع شیلات می باشد.
مواد تشکیل دهنده فعال در غضروف بسیار پیچیده هستند. غضروف ترکیبی از بافت همبند بوده که از پروتئین مانند انواع مختلف کلاژن ها، گلیکوزآمینوگلیکان ها تشکیل شده است .[2] در سرتاسر جهان افزایش تقاضا براي تولید کلاژن و ژلاتین در صنایع غذایی و دارویی وجود دارد. ژلاتین و کلاژن حاصل از پستانداران از محبوب ترین و گسترده ترین منابع مورد استفاده می باشند.
ولی به دلیل نگرانی هاي مرتبط با مسائل فرهنگی– اجتماعی و سلامتی از نظر مصرف کنندگان محدودیت هایی جهت استفاده وجود دارد، بنابراین در سال هاي اخیر، مصرف کنندگان به استفاده از کلاژن و ژلاتین تهیه شده از منابع دریایی مانند زیرفرآورده هاي ماهی و پستانداران دریایی نظیر پوست، استخوان، فلس، باله ها و غضروف آنها متمایل شده اند .[4 ,3] کلاژن با فرمول بسته C102H149N31O38 فراوانترین پروتئین رشته اي با منشأ حیوانی بوده که در ماتریکس خارج سلولی جانوران وجود دارد که به وسیله پروتئین ها و گلیکوزآمینوگلیکان ها1 احاطه شده است.
به طور کلی کلاژن جداسازي شده در صنایع پزشکی، دارویی و غذایی کاربرد دارد .[5] مولکول هاي کلاژن، از سه زنجیره به هم پیچیده که در اصطلاح مارپیچ سه گانه کلاژن خوانده می شود، تشکیل شده اند. در واقع این ساختار سه بعدي که به دلیل پیوند هیدروژنی درون زنجیره اي می باشد شکل هندسی منحصربه فرد کلاژن را فراهم کرده است و دلیل اصلی پایداري ساختاري آن محسوب می شود. ترکیب کلاژن داراي 20 اسیدآمینه است.
اگرچه تفاوتهایی در ترکیب اسیدهاي آمینه کلاژن هاي حاصل از منابع مختلف وجود دارد، ولی همه کلاژن ها داراي ویژگی منحصر به فرد می باشند و آن وجود مقدار زیادي گلایسین، هیدروکسی لیزین و همچنین مقدار بالاي ایمینواسید - پرولین و هیدروکسی پرولین - می باشد .[7 ,6 ,3] وجود هیدروکسی پرولین در پروتئین ها بسیار نادر است و کلاژن، تنها پروتئینی است که حاوي مقدار بیش تري از این آمینو اسید است، از این رو ارزیابی هیدروکسی پرولین روشی براي اندازه گیري غیرمستقیم کلاژن می باشد .[5]
ماهیان خاویاري از خانواده تاس ماهیان2 ، از جمله گونه هاي آبزي کم نظیري هستند که از قدمتی چند میلیون ساله بر خوردارند؛ از این رو ماهیان خاویاري را فسیل هاي زنده جهان می نامند که تا به امروز بقا دارند. فیل ماهی یا بلوگا3 از بزرگترین ماهیان دریاي خزر است، این ماهی از گونه هاي مهم آبزیان در روسیه، اروپاي شرقی، ژاپن و ایران به دلیل کاهش منابع طبیعی خاویار و گوشت ماهیان خاویاري محسوب می شود.
این گونه ها به دلیل سرعت رشد، سهولت در تولید مثل، ضریب تبدیل غذایی بالاتر در مقایسه با سایر ماهی هاي خاویاري و تحمل شرایط پرورش متغیر، براي پرورش بسیار مناسب می باشند .[8] در حال حاضر، پرورش بلوگا در برخی کشورهاي اطراف دریاي خزر افزایش یافته است. در ایران اولین تجربه پرورش فیل ماهی و سایر ماهیان خاویاري در منطقه خزر در سال 1922، با تولید لاروها آغاز شد و در سال 1928 حدود دو میلیون ماهی پرورش یافت .[9]
پرورش این گونه از آبزیان جهت مصرف انسانی در سالهاي اخیر گسترش یافته است. با توجه به مزایاي تغذیه اي و میزان کلاژن در غضروف ماهیان خاویاري، این ترکیب به عنوان پسماند و مواد زائد دور ریخته می شود و از ضایعات محسوب می شود، در حالیکه به طور بالقوه داراي ارزش توسعه گسترده تر و کاربردهاي ویژه اي می باشد .[10] تاکنون براي اندازه گیري هیدروکسی پرولین در بافت هاي مختلف از روش هاي اسپکتروفوتومتري یا کروماتوگرافی استفاده شده است .[12 ,11] در این روش از هیدرولیز اسیدي یا قلیایی پودر غضروف جهت ایجاد فرم آزاد هیدروکسی پرولین و سپس با ایجاد یک مشتق رنگی و سنجش آن استفاده شده است.
.2 مواد و روش ها
ماهی خاویاري فیل ماهی یا بلوگا از مجتمع کشاورزي و پرورش آبزیان جواد الائمه - ع - خریداري گردید.
1-2 آماده سازي غضروف فیل ماهی
غضروف فیل ماهی پس از ذبح جدا شده و جهت جدا شدن امعاء و احشا و سایر بافت هاي پیوندي و عضلانی در دماي 80 درجه سانتیگراد حدود 15 دقیقه حرارت داده شد. غضروف به قطعات کوچک برش داده شده و پس از آن با آب شستشو داده شد. غضروف به دست آمده در دماي اتاق خشک شد و پس از آسیاب و نرم شدن و تبدیل به ذرات با اندازه متوسط از الک با مش 300 میکرون جهت یکنواختی ذرات عبور داده شد .[10] پودر غضروف نهایی در دماي -20 c° تا زمان استفاده نگهداري گردید.
2-2 آنالیز تقریبی غضروف فیل ماهی
آنالیز تقریبی پودر غضروف ماهی خاویاري مطابق روش هاي - 2005 - AOAC انجام شد. مقادیر پروتئین، رطوبت و خاکستر به ترتیب از طریق شماره هاي 954/01، 934/01 و 920/153 ارزیابی گردید .[13] میزان پروتئین خام با استفاده از روش کلدال - مدل Gerhardt، ساخت آلمان - و ضرب محتوي ازت در فاکتور پروتئینی 6/25 بدست آمد .[10] رطوبت به وسیله خشک کردن نمونه در آون - مدل Electrolux، ساخت سوئد - با دماي 130 درجه سانتی گراد تا رسیدن به وزن ثابت اندازه گیري شد. خاکستر کل با سوزاندن نمونه در کوره الکتریکی - مدل Qallenkamp، ساخت انگلیس - در دماي 600 درجه سانتی گراد و به مدت 8 ساعت ارزیابی گردید.
3-2 تعیین هیدروکسی پرولین
50 میلی گرم پودر غضروف ماهی خاویاري را درون لوله آزمایشگاهی شیشه اي درپیچ دار قرار داده و به آن، 5ml محلول 6 Hcl مولار افزوده و لوله در دماي 105 درجه سانتی گراد به مدت 14-16 ساعت در داخل آون قرار داده شد. سپس حجم نمونه را پس از سرد شدن لوله به 100ml رسانده و 1ml از نمونه رقیق شده را در لوله دیگري ریخته و به آن 50 میکرولیتر معرف فنل فتالئین اضافه کرده و ورتکس گردید.
با افزودن تدریجی 6 NaOH مولار همراه با ورتکس محلول نمونه ارغوانی شده و با افزودن تدریجی 1 Hcl مولار نمونه بی رنگ گردید. سپس 0/5 ml معرف کلرآمین 0/14 - T گرم کلرآمین T را در 2 میلی لیتر آب مقطر حل کرده و به آن 8 میلی لیتر از بافر استات سیترات اضافه گردید - به نمونه اضافه شد و بعد از ورتکس، به مدت 25 دقیقه در دماي اتاق نگهداري شد. بافر استات- سیترات - PH=6 - نیز با افزودن 5/7 گرم استات سدیم را به 3/75 گرم سیترات تري سدیم و 0/55 گرم اسید سیتریک در یک بالن ژوژه 100 میلی لیتري و اضافه کردن مقدار 25 میلی لیتر آب مقطر و سپس 38/5 میلی لیتر ایزوپروپانول و مخلوط کردن، و به حجم رساندن با آب مقطر حاصل گردید.
سپس با افزودن 1 ml معرف ارلیخ 2/5 - گرم از پارادي متیل آمینوبنزآلدئید را در 2/7 میلی لیتر اسید هیدروکلریک غلیظ حل کرده و به آن 16 میلی لیتر ایزوپروپانول اضافه گردید - و ورتکس کردن نمونه و قرار دادن لوله در دماي 60 درجه سانتی گراد به مدت 20-25 دقیقه، یک محصول رنگی حاصل شد. سپس از یک روش پاکسازي اسید- باز جهت حذف مواد رنگی مزاحم استفاده شد.
