بخشی از مقاله
خلاصه
اگرچه گامتوفیت ماده در آنژیوسپرم شامل هفت سلول میشود، اما داراي شبکه بیولوژیکی پیچیدهاي است. در این تحقیق با استفاده از دادههاي ریزآرایه گامتوفیتهاي ماده و به کار گیري آنها درون دیتابیسآرابیدوپسیس، یک نقشه اثر متقابلیِ پروتئین - پروتئین از گامتوفیت ماده بر اساس فرآیندهاي بیولوژیکی و عملکرد مولکولی پروتئینها ساخته شد.
گروههاي کارکردي و بیولوژیکی از شبکه، نظیر فیتوهورمونها، دفاع گیاه، مرگ سلولی، حاملها و هیدرولیززها مورد تحقیق قرار گرفتند تا اعضاي مهم و حیاتی مشخص گردند. به طور قابل توجهی متوجه ارتباطات جدید و مهمی میان ژنهایی نظیر شدیم. موقعیتهاي ژنهاي با بیان بالا و پایین گامتوفیت ماده در شبکه و رابطه آنها با مسیرهاي بیولوژیکی نمایش داده شد.
مقدمه
چرخه زندگی گیاهان مابین نسل یک گامتوفیت هاپلوئید و یک اسپروفیت دیپلوئید در تناوب است. گیاهان گلدار داراي دو گامتوفیت هستند: گامتوفیت ماده و گامتوفیت نرگامتوفیت. ماده عموماً شامل هفت سلول و چهار نوع مختلف میباشد: یک سلول تخم ، یک سلول مرکزي، دو سلول سینرژید و سه سلول آنتیپودال.
تلاشهاي بسیاري انجام شده است که مشخص شود گامتوفیتهاي ماده چگونه ویژگیهاي خود را به دست میآورند و کدام ژنها در سلولهاي مختلف کیسه جنینی داراي بیان متفاوتی هستند و این ژنها چگونه تنطیم و بیان شده اند. آنالیز عملکرد تعداد کمی از این ژنها مانند - 5 - - FIE - FERTILIZATION-INDEPENDENT ENDOSPERM ، MEDEA - 10 - - MEA - ، - 6 - AGAMOUSE-LIKE - AGL80 - مورد تحلیل قرار گرفته اند.
پروتئینها نقش بسیار مهمی نه تنها در سطح سلول، بلکه در سطوح بافتی دارند. از این رو، شبکه اثر متقابل پروتئین-پروتئین - PPI1 - در فهم بهتر سیستمهاي بیولوژیکی کمک میکند. شبکههاي PPI با استفاده از هر دو روش آزمایشی و محاسباتی ساخته شد. روشهاي محاسباتی میتواند حداقل براي پیشبینی اثر متقابل ها با استفاده از داده بیولوژیکی قابل دسترس، مفید باشد. شبکه میتواند رابطه پروتئینها را بر اساس فعالیت آنها در سطوح مولکولی - عملکرد مولکولی - یا عملکرد آنها در سطوح سلولی - فرآیند بیولوژیکی - نشان دهد.
یو و همکاران یک شبکه اثر متقابلی پروتئین- پروتئین کلروپلاست را بر اساس داده کاوي و روش محاسباتی ساختند . - 11 - در اینجا، این اولین تلاش براي ساخت شبکههاي PPI نمو گامتوفیت ماده براساس عملکرد مولکولی و فرآیند بیولوژیکی پروتئینها میباشد. ما همچنین زوایاي مختلف از شبکهها را مورد بحث قرار دادیم تا پروتئینهاي مهم و حیاتی داخل شبکه را شناسایی کنیم.
مواد و روش ها پایگاه داده ریزآرایه
شبکه اثر متقابل پروتئینیِگامتوفیت ماده آرابیدوپسیس از میان ژنهاي با افزایش و کاهش بیان حاصل شده، که پیش از این نشان داده شده بود که درون گامتوفیت ماده داراي بیان است. ما از دادههاي ریزآرایه Arabidopsis female gametophyte Affymetrix ATH1 oligonucleotide که در مقاله - 11 - به چاپ رسیده و به صورت آنلاین در سایت - www.plantphysiology.org - در دسترس است، استفاده کردیم
به این دلیل که سطوح با بیان بالا از mRNA همبستگی بهتري با سطوح پروتئین دارد - 2 - ژنهایی با foldchange بزرگتر از 1/5 و P-value کمتر از 0/05 به عنوان کاندیداهاي داراي بیان بالا و همچنین ژنهایی که foldchange کمتر از 0/66 و P-value هاي کمتر از 0/05 به عنوان کاندیداهاي داراي بیان پایین ، نمایش دادیم و سپس ژنهاي مشخص شده توسط - 9 - - با استفاده از real-time - PCR را اضافه کردیم.
ساخت شبکه اثر متقابل پروتئین- پروتئین - PPI -
ما براي ساخت شبکه PPI، از نرم افزار - Ariadne Genomics, Rockville, MD - Pathway Studio 5 و از روش یافتن کوچکترین ارتباطات در طی کوتاهترین مسیر استفاده و دیتابیس اثر متقابل پروتئین - پروتئین آرابیدوپسیس را براي ساخت شبکه - 3 - و آنالیز داده آزمایشی انتخاب کردیم. در شبکه اثر متقابلی هر node یک پروتئین است و nodeها توسط edgeها به هم متصل شده اند. ما از روش یافتن کوچکترین ارتباطات در طی کوتاهترین مسیر به همراه یک گروه خاص استفاده کردیم تا شبکهها را بسازیم.
شبکهها بر اساس عملکرد مولکولی و فرآیند بیولوژیکی با ژنهاي مشخص ساخته شدند و سپس نرمافزار Cytohubba براي آنالیز Hubهاي مهم و معنی دار مورد استفاده قرار گرفت. Cytohubba توپولوژي شبکههاي اثر متقابلی پروتئین- پروتئین، مانند انسان، yeast، مگس و غیره را مورد تحلیل قرار میدهد. نهایتاً در تحلیل ما چند تا از hubهاي مهم که توسط Cytohubba مشخص شد، براساس ژنهایی که از قبل توسط - 11 - و - 8 - مشخص شده بودند ، انتخاب شد تا شبکههاي مارا تائید کند.
نتایج و بحث
شبکه PPI بر اساس فرآیندهاي بیولوژیکی
شبکه PPI بر اساس فرآیندهاي بیولوژیکی شامل node 632 و edge 2362 است. درجه میانگین شبکه 7 بود. Nodeها شامل 245 عدد از ژنهاي از قبل تعیینشده میشود 74 - عدد با افزایش بیان 171 عدد با کاهش بیان - . 51 درصد از 245 عدد، عامل رونویسی بودند 10 - عدد با افزایش بیان و 41 عدد با کاهش بیان براي عوامل رونویسی - . با توجه به اندازه بزرگ نقشه، شبکه را بر اساس پروتئینهاي مهم تفریق نمودیم.
شبکه همچنین از گروههاي کارکرديِ چشمگیري همانند هورمونهاي مختلف، دفاع گیاه، هدایت سیگنال و MADS box تشکیل شده که اتصالات گستردهاي میان آنها وجود دارد. اما گروههاي دیگري نیز هستند که داراي ارتباط کمتري هستند. این امر میتواند در ارتباط با فقدان اطلاعات در موارد بعدي در مقایسه با موارد قبلی باشد. CYP74A، یک allene oxide synthase، با داشتن 117 اتصال بیشترین تعداد اتصالات را در شبکه دارا بود. CYP74A درون گامتوفیت ماده داراي بیان کمی بود. بعد از آن ADH که داراي بیان زیادي است داراي بیشترین تعداد اتصال است 74 - اتصال - . 50 درصد از 277 عدد به مرکز شبکه وصل نبودند.
شبکههاي PPI براساس عملکرد مولکولی
با استفاده از pathway studio اقدام به ساخت ساختار عملی شبکه اثر متقابلی کردیم. شبکه کلی، شامل node 260 و edge 453 ، 24 عدد ژنهاي از قبل بیان شده و ژنهاي داراي بیان کم بود. این با تحلیل دادههاي ریزآرایه ثابت بود و غیریکنواخت بودن پروتئینهاي مختلف خانواده hydrolase مانند پروتئین At5g24540 glycosyl hydrolase از At5g24550 را نشان داد . - 11 - خانواده Glycoside hydrolase نقشهاي مهمی را در بسیاري از فرآیندهاي بیولوژیکی مانند کنترل سطوح هورمونی و پاسخ دفاعی بازي میکند
اسید اسکوربیک و nodeهاي دفاعی گیاه، به ترتیب داراي بیشترین edge هستند. اسید اسکوربیک داراي نقشهاي متفاوت شامل مرگ سلولی گیاه، مقاومت در برابر بیماري، زمان گلدهی و رشد گیاه میباشد.
در ژنوم آرابیدوپسیس، فقط 4 نوع GGT وجود دارد . - 4 - بنابراین به جستجوي سه نوع از GGTها پرداختیم. به طور جالب توجهی، GGT2 - At4g39650 - داراي بیان بالایی در گامتوفیت ماده همانند GGT1 بود در صورتی که GGT3 و GGT4 داراي بیان کمی بودند. GGT2 در شبکه اتصالی را به MEA node آشکار نمود. GGTها درون مسیر هدایت سیگنال هستند. اکسین اثر متقابل میان سه ژن داراي بیان بالا را شامل - At5g53950 - CUC2، FLS2 و F18A8.11 - epoxide hydrolase - را نشان میدهد.
این اولین گزارش از شبکه اثر متقابل پروتئینها از گامتوفیت ماده آرابیدوپسیس است. ما همچنین شریکهاي داراي بیان کم را مشخص کردیم. ارتباط میان ژنهاي با بیان کم با دیگر شرکا میتواند به ما اطلاعات خوبی از مکانیزم تنظیمی بدهد. در میان گروههاي عملکرد مولکولی که بسیار ارائه شدهاند، فعالیت حامل ها، عوامل رونویسی و هیدرولیزها هستند که هنوز تحقیقات کمی در مورد آنها انجام شده است.
اگرچه اکثر ژنها در گامتوفیت ماده، نقش غیر تنظیمی از خود نشان دادهاند و خیلی از آنها نمیتوانند edge بسازند، بنابراین از شبکه حذف میشوند. این اتفاق ممکن است در اثر کمبود اطلاعات در مورد عملکرد و فرآیند بیولوژیکی خیلی از ژنها و اثر متقابل آنها باشد. این یافتهها نشان میدهد که پیشرفت و عملکرد گامتوفیت ماده توسط شبکه پیچیدهاي کنترل میشود. یافتههاي بیشتر در فهم بهتر ارتباط میان این مسیرها در گامتوفیت ماده کمک کننده خواهد بود.
