بخشی از مقاله
چکیده
پاتوتیپ های نکروتوکسیژنیک - NTEC - و مهاجم روده ای - EIEC - اشریشیاکلی از مهمترین پاتوتیپ های بیماری زای روده ای محسوب میگردند. هدف از انجام این مطالعه شناسایی جدایه های نکروتوکسیژنیک و مهاجم روده ای اشریشیاکلی و تعیین فراوانی آنها از جدایه های مدفوع گوساله های سالم در دامداری های اطراف کرمان میباشد. سوآپ های رکتال از 171 گوساله سالم اخذ شد، نمونه ها بر روی محیط های مناسب کشت داده شد و پس از تایید بیوشیمیایی جدایه های اشریشیاکلی مورد بررسی مولکولی قرار گرفت.
به منظور شناسایی جدایه های مثبت از نظر ژن های حدت cnf و cdt و ipaH آزمایش PCR صورت پذیرفت. جهت شناسایی پاتوتیپ EIEC ژن ipaH مورد آزمایش قرار گرفت که مشخص گردید در 171 جدایه مورد مطالعه 1 جدایه 0/59 - درصد - واجد ژن ipaH ، همچنین جهت شناسایی پاتوتیپ NTEC ژن cnf1 مورد آزمایش قرار گرفت که بر این اساس فراوانی پاتوتیپ NTEC، 4/11 درصد 7 - جدایه - بود.
مقدمه
اکثر سویه های اشریشیاکلی به صورت طبیعی در دستگاه گوارش انسان و دام ها حضور دارند اما برخی از آن ها بیماری زا بوده و قادرند بیماری های گوارشی و خارج گوارشی ایجاد نمایند. سویه های بیماری زا قابلیت تولید و نمود طیف وسیعی از عوامل حدت را دارند که بر این اساس به پاتوتیپ های مختلفی از جملهانتروتوکسیژنیکّ نکروتوکسیژنیک، تولید کننده شیگاتوکسین و غیره تقسیم میشوند .
- Ghanbarpour et al., 2010 - سویههای اشریشیاکلی نکروتوکسیژنیک دارای دو جدایه NTEC1 و NTEC2 میباشد. جدایه NTEC1 در انسان و حیوانات ایجاد اسهال، سپتی سمی و عفونت سیستم ادراری میکند در حالی که NTEC2 تنها در بره ها و گوساله ها ایجاد اسهال و سپتی سمی می کند. این سویه ها توسط فیمبریه و فاکتورهای چسبنده غیر فیمبریه ای و فاکتور چسبنده منتشره در روده کلونیزه میشوند و تولید توکسین میکنند $U VR\ HW DO.'2008; .Borriello et al., 2010 - سویه های اشریشیاکلی نکروتوکسیژنیک تولید 3 نوع توکسین - CNF1 ,CNF2 ,CNF3 - میکنند.
سویه های اشریشیاکلی انترواینواسیو، می توانند هم اسهال آبکی و هم اسهال خونی که شبیه دیسانتری می باشد ایجاد نمایند. سویه های EIEC از نظر خواص بیوشیمیایی، ژنتیکی و پاتوفیزیولوژیک شبیه به سویه های شیگلا میباشند. سویه های EIEC به واسطهی داشتن خصوصیات تهاجمی شناسایی میگردند . - Resta -Lenert et al., 2003 - سویه های اشریشیاکلی انترواینواسیو جز سروتیپ هایO124¬ ، O143، O164 میباشند. این باکتری قادر است به اپی تلیوم روده بزرگ تهاجم نموده و آن ها را تخریب کند و موجب بیماری شود.
در ابتدا اسهال آبکی است اما به زودی مشابه اسهال دیسانتری باسیلی شده و خون و موکوس درمدفوع دیده میشود . - Sharma et al.,2006; Burns et al., 1980 - جدایه های EIEC عامل بیماری اسهال در دهه 1970 شناسایی شدند. شیوع EIEC معمولا همراه با آب یا غذای آلوده با مدفوع انسان یا انتقال شخص به شخص است اما شیوع در کشور های صنعتی کم است. در سال 2012 شیوعی در ایتالیا گزارش شد و 109 نفر در اثر خوردن سبزیجات پخته آلوده در یک رستوران بیمار شدند . - Shetty et al., 1998 -
این گروه اغلب در حیوانات بیماری های خفیفی را ایجاد می کنند و معمولا منجر به سپتی سمی نمی شوند اما توانایی ایجاد انتریت را دارند. این دسته به وسیله ژن های حدتی که روی پلاسمید مهاجم حضور دارند به اپیتلیوم ناحیه کولون روده هجوم می برند. همچنین می توانند تولید توکسین Sen کنند، در نتیجه ایجاد اسهال آبکی می کنند که در موارد شدید می تواند همراه با کمی خون و موکوس باشد. برای تشخیص آن ژن ipaH را که هم در کروموزوم و هم در پلاسمید حضور دارد را شناسایی میکنند . - Fitzhenry et al., 2002 - با توجه به اهمیت بیماری زایی سویههای نکروتوکسیژنیک و انتروانویزیو در نشخوارکنندگان هدف از این مطالعه شناسایی ژن های حدت cnf و cdt و ipaH در گوساله های سالم است.
مواد و روشها
در این مطالعه از 171 گوساله سالم در دامداری های اطراف کرمان سواب راست روده تهیه گردید. سواب ها بعد از انتقال به آزمایشگاه میکروبیولوژی دانشکده دامپزشکی، در محیط مک کانکی جهت جداسازی اشریشیاکلی کشت داده شدند. کلنی های مشکوک طیق روش های معمول آزمایشگاهی مورد بررسی قرار گرفت . - Markey et al., 2013 - در آخر از کلنی های تایید شده به عنوان اشریشیاکلی یک کلنی انتخاب شد و با افزودن %30 گلیسرول به محیط مایع لوریا برتانی در دمای -20 درجه سانتی گراد ذخیره شدند.
در مرحله بعد برای انجام آزمایش PCR ، ابتدا DNA به روش جوشاندن استخراج گردید. برای شناسایی سویه های NTEC از توالی پرایمرهای معرفی شده در مطالعهی بوست و همکاران در سال 2001 به صورت سیمپلکیس PCR استفاده شد . - 23 - توالی پرایمرها در جدول 3-3 آورده شده است. از DNA استخراج شدهی سویهی استاندارد اشریشیاکلی 1404 به عنوان کنترل مثبت و سویهی استاندارد اشریشیاکلی MG1655 به عنوان کنترل منفی در PCR استفاده گردید.
برای شناسایی سویه های ETEC و EIEC از توالی پرایمرهای معرفی شده در مطالعهی آراندا و همکاران در سال 2004 به صورت مولتی پلکیس PCR استفاده شد DNA . - Van et al., 2001 - استخراج شدهی سویهی استاندارد - اشریشیاکلی b - 85برای EIEC به عنوان کنترل مثبت و سویه ی استاندارد اشریشیاکلی MG1655 به عنوان کنترل منفی در واکنش PCR استفاده گردید. حجم واکنش 3&5 O25 بود و غلظت اجزای آن شامل O5/2 بافر x10، mM2 منیزیم کلراید، mM2/0 dNTPs، 03/0 پرایمر، U1 DNA پلیمراز، O5 1$ و آب مقطر تا حجم واکنش بود. تمامی اجزای تجاری واکنش از شرکت سیناکلون - ایران - تهیه گردید.
نتایج و بحث
براساس آزمایشات بیوشیمیایی انجام شده از مجموع 171 نمونه کشت داده شده، 171 جدایه اشریشیاکلی مورد تایید قرارگرفت. جهت شناسایی پاتوتیپ NTEC ژن cnf1 مورد آزمایش قرار گرفت که بر این اساس فراوانی پاتوتیپ NTEC، 4/11 درصد 7 - جدایه - بود. پاتوتیپ NTEC در %4/1 از جدایه ها وجود داشت که از مطالعات مشابه در اسپانیا - %15/8 - و ایتالیا - %20/9 - کمتر است اما فراوانی پاتوتیپ NTEC در این مطالعه مشابه مطالعات قبلی در ایران بود 22 - ، 120 و . - 159 پاتوتیپ NTEC هم از گوساله های سالم و هم اسهالی جدا شده است .
بنابراین نقش آن در ایجاد اسهال واضح نیست - Orden .et al.,2002 - مطالعه انجام شده بر روی روی سویه های اشریشیاکلی جدا شده از گوساله های سالم و بیمار در سال های 1970-1958 نشان داد که 8-7 درصد آنها متعلق به پاتوتیپ نکروتوکسیژنیک بوده و اکثر آنها متعلق به سویه های نکروتوکسیژنیک نوع 2 بوده اند گرچه 5 جدایه اشریشیاکلی نیز از موارد گوساله های سالم متعلق به سویه های نکروتوکسیژنیک نوع 1 بودند، اگرچه در این مطالعه انجام شده سویه های نکروتوکسیژنیک نوع 2 جدا نشد و فقط از نوع نکروتوکسیژنیک نوع 1 بودند به مطالعه ما شباهت دارد .
- Van et al., 2001 - جهت شناسایی پاتوتیپ EIEC ژن ipaH مورد آزمایش قرار گرفت که بر این اساس فراوانی پاتوتیپ EIEC ، 0/59 درصد 1 - جدایه - بر آورد گردید. در مطالعه ما تنها یک جدایه متعلق به پاتوتیپ EIEC بود که مشابه مطالعه دیگری در ایران است . - Ghanbarpour et al., 2009 - پاتوتیپ های EIEC به ندرت از گوساله ها جدا می شوند زیرا آن ها دلیل اصلی ایجاد اسهال در انسان هستند - Servin, 2005; Weintraub, 2007 -
بعضی فاکتور ها مثل مدیریت فارم، آب و هوا و سن ممکن است روی شیوع پاتوتیپ ها اثر بگذارد . - Wang et al., 2013 - در بعضی از مطالعات دلیل شناسایی کمتر پاتوتیپ ها را تفاوت در روش های تشخیصی می دانند اما اخیرا نقش عدم توانایی روش های تشخیصی در شناسایی پاتوتیپ ها رد شده است . - Kolenda et al., 2013 - بر اساس نتایج این مطالعه می توان نتیجه گیری نمود که سویه های نکروتوکسیژنیک و مهاج روده ای اشریشیاکلی در گوساله های سالم در منطقه کرمان حضور داشته است ولی با این وجود که فقط تعداد اندکی از جدایه ها دارای ژن های مورد نظر بودند، اهمیت سویه های نکروتوکسیژنیک را نمی توان به درستی تعیین کرد.
