بخشی از مقاله
چکیده
miRNAها، مولکولهاي کوچک غیرکدکننده هستند که بیان ژنها را از طریق ایجاد برش در mRNA یا ممانعت از ترجمه تنظیم میکنند. این مولکولها در بسیاري از فرآیندهاي مختلف بیولوژیکی و متابولیکی گیاه نقش داشته و با تنظیم حساس و دقیق ژنها، امکان پاسخ مناسب گیاه به تغییرات مراحل رشدي یا شرایط محیطی را فراهم میکنند.
در این مطالعه از توالییابی با کارایی بالا به منظور شناسایی miRNAهاي در گیر در پاسخ گیاه برنج به تنش خشکی استفاده شد. از میان miRNA 708 شناخته شده برنج miRNA 88 تغییر بیان معنیداري را نشان دادند. بسیاري از miRNAهایی که تغییر بیان نشان دادند بودند، در تنظیم بیان ژنهاي کدکننده فاکتورهاي رونویسی و پاسخ به تنش نقش دارند.
مهمترین مسیرهایی که این miRNAها در کنترل آنها نقش داشتند، مسیر پیام رسانی اکسین، مسیر پیام رسانی اسید ابسزیک و مسیر کنترل گلدهی گیاه بودند. نقش هورمونهاي گیاهی در پاسخ به تنش اثبات شده و تنظیم بیان این هورمونها در سطح پس از رونوشت برداري ژنهاي کدکننده آنها نشان دهنده راهکار گیاه برنج با بکارگیري miRNAها در پاسخ به تنش خشکی میباشد.
در این مطالعه همچنین چندین miRNA جدید در برنج شناسایی شد. این نتایج درك بهتري از نقش miRNAها در پاسخ گیاه در مواجه با تنش ارائه داده و نشان داد که miRNAها نقش مهمی را به عنوان فاکتور کلیدي در کنترل پاسخ برنج به تنش خشکی ایفا میکنند.
مقدمه
برنج یکی از مهمترین محصول گیاهی بوده و تامین درصد بالایی از کربوهیدرات مورد نیاز مردم جهان را به خود اختصاص داده است. تنش خشکی از مهمترین و رایجترین تنشهاي غیرزیستی می باشد که تولیدات کشاورزي را با محدودیت روبهرو ساخته و بازده تولید را کاهش داده است miRNA . - Kramer and Boyer 1995 - ها مولکولهاي RNA کوچک تکرشتهاي غیرکدکننده و تنظیمی هستند که طولی بین 19 تا 24 داشته و باعث خاموشی ژن در مرحله پس از رونویسی به وسیله هدایت mRNAهاي هدف به سمت تجزیه یا جلوگیري از ترجمه آن میشوند.
miRNAها مانند ژنهاي کدکننده پروتئین توسط RNA پلیمراز1II رونوشت برداري میشوند . - Lee, Kim et al. 2004 - رونوشت RNA تکرشتهاي در ابتدا ساختار ساقه-حلقهاي را شکل میدهد که پس از دو مرحله برش در ناحیه ساقه توسط آنزیم DCL12، تولید مولکول دو رشتهاي کوچکی با انتهاي 3´ آزاد میکند که با عنوان miRNA/miRNA* شناخته میشود . - Flynt and Lai 2008 - سپس این مولکول کوچک دو رشتهاي درون مجموعهاي از پروتئینها با عنوان مجموعه خاموشی القا شونده توسط - RISC - 3 RNA، وارد شده و رشته اصلی که miRNA است و از این مرحله miRNA بالغ4 نامیده میشود، درون پروتئینی به نام آرگونات5 که عضو اصلی این مجموعه است قرار میگیرد و رشته مقابل حذف میشود
مجموعه خاموشی در این لحظه قابلیت شناسایی ژن هدف را داشته و بر اساس مکمل بودن بازها میان miRNA و ژن هدف به آن متصل شده و عمل تجزیه mRNA یا ممانعت از ترجمه انجام میشود . - Bartel 2005 - miRNAها نقش مهمی را در رشد، نمو و پاسخ به محركهاي محیطی زنده و غیرزنده ایفا میکنند - Khraiwesh, Zhu et al. . - 2012; Ehya, Monavarfeshani et al. 2013 امروزه تلاشهاي بسیاري به منظور شناسایی و استفاده از miRNAها در تنظیم بیان ژنها در پاسخ به تنشها انجام شده است
انجام مطالعات مولکولی با بهرهگیري از تکنیکهاي پیشرفتهاي نظیر توالییابی با کارایی بالا - high-throughput sequencing - که به تازگی توسعه یافته اند، امکان مطالعه miRNA ها را در سطح وسیع، میسر کردهاست. در واقع این تکنیکها امکان بررسی الگوي بیان و فعالیت miRNAها در بافتها، ژنوتیپها یا شرایط محیطی خاص فراهم نمودهاند
یکی از متداولترین کاربردهاي این تکنیکها بررسی تغییر بیان miRNAها در مواجهه با تنش-هاي زیستی و غیرزیستی میباشد. در مطالعهاي که توسط - 2008 - Zhu et al بر روي برنج به منظور بررسی بیان miRNA ها در طی نمو بذر در دو مرحله 5-1 و 10-6 روز بعد از گرده افشانی انجام شد، دو miRNA در مرحله 5-1 و چهار miRNA در مرحله 10-6 افزایش بیان نشان دادند . - Zhu, Spriggs et al. 2008 - همچنین تعداد miRNA 29 جدید در بررسی miRNAهاي دخیل در طی جوانهزنی بذر برنج شناسایی شدند که در اکثر موارد افزایش بیان اینها با کاهش بیان ژنهاي هدفشان همراه بود
Xue, miRNA .. هاي گیاهچههاي برنج در دو شرایط نرمال و تیمار با H2O2 مورد بررسی قرار گرفتند و هفت miRNA در شرایط تیمار H2O2 تغییر بیان نشان دادند. با بررسی ژنهاي هدف این miRNAها مشخص شد که این ژنها درپاسخ هاي سلولی و فرایندهاي متابولیکی شامل تنظیم رونوشت برداري، انتقال مواد غذایی، تکثیر سلولی و مرگ برنامهریزي شده سلول نقش دارند . - Li, Li et al. 2011 - در بررسی که بر روي گندم به منظور شناسایی miRNAهاي دخیل در پاسخ به تنش گرما انجام شد، یک miRNA افزایش بیان و هشت miRNA کاهش بیان نشان دادند . - Xin, Wang et al. 2010 - با توجه به گزارشهاي موجود بیان miRNAها نه تنها در شرایط مختلف بلکه در گیاهان مختلف نیز متفاوت است . بنابراین لزوم بررسی تغییر بیان miRNAها براي هر گیاه در شرایط مختلف به صورت جداگانه ضروري است. با توسعه تکنیکهاي نوین توالییابی، miRNAهاي زیادي در برنج شناسایی شدهاند
با این وجود تاکنون همه miRNAهاي موثر در کنترل ژنهاي پاسخدهنده به تنش، مورد بررسی قرار نگرفتهاند. شناسایی و بررسی تغییر بیان miRNAها به تنهایی کافی نبوده و شناسایی ژنهاي هدف انها گام موثر بعدي در شناسایی مسیرها و نحوه اعمل اثر miRNAها میباشد. از مهمترین راههاي شناسایی ژنهاي هدف miRNAها استفاده از روشهاي بیوانفورماتیک بر اساس مکمل بودن miRNAها و مکان اتصال آنها در ژنهاي هدف میباشد. miRNAهاي گیاهان برخلاف جانوري معمولا درجه مکمل بودن بالایی را با ژنهاي هدف خود نشان میدهند و به همین دلیل، شناسایی ژنهاي هدف در گیاهان نسبت به جانوران از دقت و صحت بالاتري برخوردار است
همچنین میزان مکمل بودن توالی miRNA و ژن هدف نقش اصلی را در هدایت به سوي برش mRNA ویا جلوگیري از ترجمه ان ایفا میکند. تلاشهاي بسیاري در طی سالها منجر به شناسایی هزاران ژن شده که در پاسخ به تنشها نقش دارند و امروزه مشخص شده که برخی از این ژنها توسط miRNAها کنترل میشوند . - Jung, Seo et al. 2009 - ژنهاي هدف شناسایی شده شامل ژنهاي دخیل در بسیاري از فرایندهاي نموي گیاه نظیر تکثیر سلولی، نمو برگ و گل، گلدهی و همچنین پاسخ گیاه به تنشهاي زنده و غیرزنده میشوند
تنش خشکی یکی از مهمترین عوامل کاهنده عملکرد می باشد و کشور ایران از جمله کشورهایی است که قسمت عظیمی از وسعت آن از لحاظ وضعیت آب و هوایی، خشک و نیمهخشک محسوب میشود . - Ganjeali, Porsa et al. 2011 - تنش خشکی باعث تغییر در تنظیم بیان ژن میشود و شناسایی چگونگی این تنظیمات نقش مهمی را در درك هرچه بهتر نحوه پاسخ گیاه به تنش ایفا می کند. با توجه به اینکه miRNA ها نقش تنظیمی داشته و این نقش را با کنترل ژنهاي هدف ایفا میکنند، این مطالعه به منظور شناسایی miRNAهاي مسئول تنظیم پاسخ به تنش خشکی و ژنهاي هدف بالقوه آنها در برنج انجام شد.
مواد و روشها
مواد گیاهی و اعمال تیمار
در این مطالعه از ژنوتیپ IR64، تهیه شده از موسسه بینالمللی برنج6 استفاده شد. بذور برنج پس از ضد عفونی سطحی به مدت 3 روز در دماي 30°c روي کاغذ صافی مرطوب درون پتري دیش جوانهدار شده و سپس به محیط کشت هیدروپونیک حاوي محلول یوشیدا منتقل شدند . - Yoshida, Forno et al. 1971 - محلول غذایی هر هفته تعویض شده و pH محلول روزانه اندازهگیري و در محدوده 5/5-5 تنظیم شد. شرایط نوري به صورت 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی و دماي 27°c اعمال شد. پس از دو هفته گیاهچهها به گلدانهاي حاوي دو قسمت خاك رس و یک قسمت ماسه منتقل شدند و به مدت دو هفته همه گلدانها به صورت کامل آبیاري شدند
