بخشی از مقاله
شناسايي ژن هاي واکنش به تنش در پاسخ گياه نخود به تنش خشکي
چکيده
تنش خشکي يکي از چالش هاي اصلي توليد نخود بوده و يکي از اجزاء اصلي برنامه هاي اصلاحي اين گياه به شمار مي رود. اين پژوهش به منظور درک اساس مولکولي تحمل خشکي با مقايسه بيان ژن هاي واکنش به تنش در ژنوتيپ هاي حساس و متحمل گياه نخود تيپ کابلي انجام شد. آناليز بيان ژن با استفاده از روش cDNA-AFLP نشان داد که ژن هاي دخيل در بيوسنتز پروتئين ها نظير پروتئين ريبوزوميS٨، ژن هاي دخيل در متابوليسم ماکرومولکول ها شامل چپرون هاي ميتوکندريايي، پروتئازها، هيدرولازها وآنزيم هاي ديگر نظيرUDP گلوکورونيک اسيد دکربوکسيلاز و ايزوفلاونوئيد دهيدراتاز، ژن هاي فراهم کننده انرژي نظيرNADH دهيدروژناز؛ ژن هاي دخيل در نقل و انتقال سلولي نظير ناقل هاي کلر؛ ژن هاي دخيل در ترارساني نظير کالمودولين و رسپتور ABA، ژن هاي دخيل در تنظيم رونويسي نظيرهيستون داستيلاز و ژن هاي دخيل در تقسيم کلروپلاست به عنوان ژن هاي واکنش به تنش خشکي در گياه نخود شناسايي شدند.
واژه هاي کليدي: بيان ژن ، تنش خشکي، ترانسکريپتوم ،نخود کابلي، cDNA-AFLP.
مقدمه :
پاسخ به تنش خشکي با درک تنش توسط گياه آغاز مي شود، سپس موجب فعال سازي مسيرهاي ترارساني سيگنال براي انتقال اطلاعات به درون يک سلول خاص و يا سرتا سر گياه شده و همزمان با آن تغييرات در بيان ژن ها اتفاق افتاده و پاسخ هاي سازشي گياه براي تغيير رشد و نمو گياه صورت مي پذيرد ( Wang and ٢٠٠٧ ,Bughrara). مطالعه در خصوص پاسخ هاي مولکولي گياهان در مواجهه با تنش خشکي، تغييرات زيادي را در بيان ژن ها روشن ساخته است . اين ژن ها موجب کد شدن پروتئين ها يا فرآورده هايي مي شوند که نقش مهمي در پاسخ گياه به تنش خشکي ايفا مي کنند(٢٠٠١ ,.Romo et al).
تنوع ژنتيکي در پاسخ به تنش اساسا به واسطه اختلاف در بيان ژن هاي پاسخ دهنده به تنش است . تعداد زيادي از ژن ها توصيف شده اند که در سطح رونويسي به خشکي پاسخ مي دهند و ژن هاي القاء شده با تنش از طريق انتقال ژن براي اصلاح تحمل تنش گياهان به کار گرفته مي شوند. بنابراين ضرورت دارد که براي فهم مکانيسم هاي دخيل در تحمل تنش در گياهان ، اعمال ژن هاي القاء شده با تنش بررسي شود(٢٠٠٧ ,.Kiani et al). بررسي همبستگي بين سازش هاي فنوتيپي با پاسخ هاي مولکولي اين امکان را فراهم مي کند که نقش تغييرات القا شده با خشکي در بيان ژن در طي فرآيندهاي سازش مورد بررسي قرار گيرد. به عبارتي ارتباط بين بيان يک ژن با درجه بالاي تحمل تنش در يک گونه به نقش احتمالي آن ژن در سازش اشاره دارد (٢٠٠٧,.Kiani et al ). بررسي پروفيل ترانسکريپتوم گام اول در شناسايي و تعيين عمل ژن هاي مربوط به يک پديده بيولوژيک در پاسخ به القاء کننده هاي محيطي به شمار مي رود ( Wang and .(Bughrara, 2005
اين پژوهش با هدف فهم اساس مولکولي واکنش به تنش خشکي از طريق مقايسه بيان ژن ها و شناسايي ژن هايي که در واکنش به تنش خشکي القاء شده و داراي اختلاف بيان در ميان ژنوتيپ ها ي حساس و متحمل مي باشند بر روي ژنوتيپ هاي حساس و متحمل به خشکي نخود به اجرا درآمد.
مواد و روش ها
دو لاين ICCV٢ و FLIPC9855 به عنوان لاين هاي متحمل و لاين ILC3279 به عنوان لاين حساس به خشکي در اين مطالعه وارد شدند. پس از گلدهي گياهان در معرض سه تيمار مختلف آبياري منظم و مناسب نظير آنچه که قبل از آغاز گلدهي انجام ميشد به عنوان تيمار کنترل (T١)، تنش متوسط (T٢) و تنش شديد(T٣) قرار گرفتند. اعمال تنش از طريق کاهش ميزان رطوبت خاک گلدان ها به ميزان ٥٥-٦٠ درصد ظرفيت زراعي در تيمار T٢ و ٢٥-٣٠ درصد ظرفيت زراعي در تيمار T٣ صورت گرفت و از اين زمان به بعد ميزان رطوبت از طريق وزن نمودن روزانه گلدان ها در همين حد حفظ شد و زماني که رطوبت بيش از اين مقدار کاهش يافت ، کاربرد آب تا اندازه اي صورت گرفت که رطوبت خاک در حد مورد نظر باقي بماند. نمونه برداري در زمان هاي يک ، سه و پنج هفته پس از اعمال تنش از برگ گياهان صورت پذيرفت .
براي استخراج Total RNA از کيت استخراج RNeasy Plant Mini Kit شرکت کياژن (٧٤٩٠٤ .Cat. No) و براي حذف DNAي ژنومي از آنزيم DNaseI ساخت شرکت Fermentas (EN٠٥٢١) استفاده شد. First strand cDNA
با استفاده از کيت RevertAidTM First strand cDNA Synthesis Kit شرکت Fermentas (K١٦٢٢) تهيه شد. تکنيک cDNA-AFLP بر روي cDNAهاي دو رشته اي(١٩٩٦ ,.Bachem et al) با کاربرد آنزيم هاي برشي Mse١ و ECoR١ و ٦ ترکيب پرايمري مختلف انجام پذيرفت . تفکيک قطعات تکثير شده با استفاده از دستگاه الکتروفورزعمودي Gen-BioRAD Sequi انجام شد. پس از پايان الکتروفورز از رنگ آميزي نيترات نقره جهت مشخص کردن الگوي باندي استفاده گرديد. پس از رنگ آميزي ژل ، باند هائي که در ژنوتيپ (هاي) متحمل نسبت به ژنوتيپ حساس بيان متفاوت نشان مي دادند، و يا در اثر تنش در هر يک از ژنوتيپ ها افزايش و يا کاهش بيان نشان داده بودند از ژل جدا شدند. مجددا تکثير شده ، خالص سازي شده و براي تعيين توالي ارسال شدند. توالي هريک از قطعات مشتق از رو نوشت جدا شده از ژل با استفاده از الگوريتم BLASTx مورد آزمون همرديفي قرار گرفت . توالي هائي که با اين روش با توالي مورد نظر ما بيشترين شباهت را داشتند دانلود شده و همراه با توالي آمينواسيدي قطعه مورد جستجو در نرم افزار clustal w وارد شدند و به اين ترتيب ميزان شباهت اين پروتئين با پروتئين هاي مشابه از ديگر گونه ها خصوصا گونه هاي خانواده حبوبات مورد بررسي قرار گرفت و عمل احتمالي آنها تعيين شد.
نتايج
با استفاده از ٦ ترکيب پرايمري در مجموع ٢٩٥ قطعه مشتق از رونوشت (TDF) توليد شد. اندازه قطعات بين ١٠٠-٦٠٠ جفت باز متغير بود. پروفيل ترانسکريپتوم برگ در هر سه ژنوتيپ حساس و متحمل از نخود زراعي هم از نظر تعداد و هم از نظر نحوه توزيع شان روي ژل تنوع زيادي را نشان نداد. بنابراين فرضيه وجود اختلافات چشمگير دربين ژنوتيپ هاي حساس و متحمل از نظر رونوشت هاي بيان شده و يا القاء شده آنچنان تحقق پيدا نکرد و آنچه که بيشتر ملاحظه مي شد پاسخ هاي متنوع در تک تک ژنوتيپ ها بود.
از ميان قطعات ، ١٥٨ قطعه الگوي بيان متفاوتي را در اثر تنش نشان دادند( جدول ١). باندهاي تغيير يافته در اثر تنش به چهار بخش تقسيم شدند. بخش اول تحت عنوان باندهاي جديد شامل TDFهايي بودند که قبل از اعمال تنش در ارقام حساس و
