بخشی از مقاله
چکیده
با پیشرفتهای اخیر در زیستشناسی مولکولی و توسعه فناوریهایی مثل توالییابی ژنی و ژنومی، کشف و شناسایی گونههای جدید در گروههای مختلف موجودات زنده به ویژه قارچها روند افزایشی به خود گرفته است. همچنین با توجه به ناکارآمدی روشهای مبتنی بر مورفولوژی برای شناسایی گونههای قارچی، استفاده از تکنیکهای جدید مبتنی بر دادههای DNA، جایگاه خاصی را در شناسایی سریع و دقیق گونههای قارچی پیدا کرده است. توالییابی از طریق نواحی فاصلهانداز بین-ژنی اپران RNA ریبوزومی یکی از این تکنیکها میباشد. بدین منظور ژن نمونه با کد شناسایی 18 پس از جداسازی و استخراج DNA وتکثیر با PCR توسط شرکت Bioneer توالییابی شد، سپس توالی شناسایی شده پس از ویرایش، در موتور جستجوی بانک جهانی - NCBI - مورد همردیفی - BLAST - قرار گرفت. نتایج بدست آمده از طریق همردیفی و آنالیز خوشهای
.1 مقدمه
در عصر حاضر، شناسایی عمومی گونهها از صفات ظاهری به سمت جنبههای ژنتیک و تکامل آنها سوق پیدا کرده و هنگامی که خصوصیات مورفولوژیکی کارایی لازم را برای تشخیص ندارند، لذا روشهای مولکولی به عنوان یک روش تکمیلی و ابزاری بسیار مهم و قدرتمند جهت شناسایی تنوع ژنتیکی و همچنین شناسایی و معرفی گونههای جدید گیاهی کاربرد دارد. یکی از روشهای مولکولی که برای چنین ارزیابیهایی مورد استفاده قرار میگیرند نشانگر Internal Transcribed - ITS - Spacer میباشد. ITS که نواحی حفاظت شده بین زیر مجموعه بزرگ و کوچک DNA ریبوزومی را شامل میشود یا به عبارتی دیگر توالیهایی از DNA که RNAهای ریبوزومی را کد میکنند نواحی مناسبی جهت بررسی روابط فیلوژنتیکی و سیستماتیک و همچنین قرابت ژنتیکی بین قارچها در سطوح جنس و درون جنس حساب میآیند. گروهبندی براساس rDNA یک روش قابل اعتماد برای تعیین جایگاه صحیح جدایههای قارچ است. علاوه برآن روشهای متنوعی بر پایه PCR جهت تشخیص و طبقهبندی قارچها، ابداع گردیده است 1]، .[2 تحقیقی دیگر در 45 جدایه از AGها و زیرگروههای مختلف نشان داده شد که توالیهای rDNA5/8sشدیداً حفاظت شدهاند، اما تفاوتهای قابل توجهی در حد فاصل قطعات 18 و 28S فیلوژنی در ناحیه ITS بین جدایهها وجود دارد .[3]
.2 مواد و روشها
جداسازی و خالص سازی عامل بیماریزا
عوامل بیماریزای قارچی که ناشناخته بودند توسط کارشناسان مرکز تحقیقات کشاورزی جمع آوری و کشت شده بودند. سپس سه نمونه از آنها به صورت کد X و 18 و 70 نامگذاری و برای استخراج DNA آماده شدند. جهت استخراج DNA قارچ ها از روش CTAB و با استفاده از نیتروژن مایع -196 - درجه سانتیگراد - استفاده شد. در این مرحله قارچ های کشت شده را از محیط کشت آنها بر روی کاغذ صافی عبور داده و در نهایت قارچ باقیمانده رطوبت گیری شده و سپس روی آنها در داخل هاون چینی ازت مایع ریخته شد و بلافاصله پودر شدند. سپس در محلول حاوی CTAB و مواد لیز کننده غشا - به روش - CTAB ریخته شدند و به مدت 30 دقیقه در بن ماری 60 درجه سانتیگراد قرار گرفتند. در مرحله بعد سانتریفوژ انجام شد و لایه رویی با استفاده از کلروفرم – ایزوامیل الکل ترکیب شد، سپس مجدد سانتریفوژ شد و بعد از اضافه کردن ایزوپروپانل سرد رسوب DNA تهیه و بعد از شستو با الکل و خشک کردن DNA، در آب دیونیزه حل گردید تا در مراحل بعدی مورد استفاده قرار گیرد.
PCR نمونهها جهت تکثیر ITS از منطقه rDNA
واکنشهای زنجیرهای پلیمراز با استفاده از آغازگرهای ITS1 و ITS4 بدینصورت که 50 میکرولیتر برای هر واکنش با استفاده از بافر PCR - 1X - ، آغازگرهای اختصاصی به میزان 200nM برای هر کدام، آنزیم تگ پلیمراز - 1 unit - ، dNTPs - 0.2 mM - ، کلرید منیزیم، - 2.5Mm - و DNA - 10 ng - ، انجام شد. برنامه حرارتی PCR به صورت یک چرخه واسرشت سازی اولیه در دمای 94 درجه سانتی گراد به مدت 2 دقیقه و 35 چرخه شامل مراحل واسرشت سازی در دمای 94 درجه سانتی گراد به مدت 45 ثانیه، اتصال در دمای 50 درجه سانتیگراد به مدت 45 ثانیه و بسط در دمای 72 درجه سانتیگراد به مدت 2 دقیقه و در خاتمه یک چرخه بسط نهایی در دمای 72 درجه سانتیگراد به مدت 7 دقیقه تنظیم شد. برای انجام الکتروفورز فرآوردههای تکثیر شده PCR از ژل آگارز با غلظت 1/5 درصد استفاده شد. قطعات DNA حاصل از واکنش زنجیرهای پلیمراز با استفاده از کیت خالص سازی شد و جهت تعیین توالی به شرکت - تکاپو زیست - ارسال شد.
تجزیه وتحلیل دادههای DNA توالییابی شده
توالیهای DNA ابتدا با بررسی جدول ارسالی شرکت Bioneer - شکل - 1 و همچنین با بررسی کروماتوگرام مربوط به نواحی ITS1,4 - شکل 2 و - 3، مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت و مشخص شد که از بین نمونههای 18، 70 و X، فقط نمونه 18دارای پیکهای مجزا است و توالی مناسبی جهت تفسیر میباشد، نمونههای 70 و X دارای سیگنالهای متعدد بوده، که میتواند به دلیل وجود باندهای غیراختصاصی باشد در نتیجه توالییابی آنها قابل استناد نیست، لذا تفسیر در مورد نمونه 18 در این گزارش به تفصیل خواهد آمد.
