بخشی از مقاله
چکیده
ژن ABF4 یک عضو از خانواده ژنی ABF و رمزکننده یک عامل رونویسی در گیاه آرابیدوپسیس است که در مسیري وابسته به اسید آبسیزیک در پاسخ به تنش رطوبتی افزایش بیان نشان داده و نقش آن در تحمل به خشکی آشکار شده است. ارتباط فیلوژنتیکی بسیار نزدیک آرابیدوپسیس و گونههاي زراعی جنس براسیکا امکان بهرهگیري از ژنوم توالی یابی شده آرابیدوپسیس را براي یافتن ژنهاي ارتولوگ در ژنوم کلزا فراهم میکند. این تحقیق با هدف جداسازي، همسانه سازي و بررسی بیان ارتولوگ ژن ABF4 در کلزا در پاسخ به تنش رطوبتی انجام شد. با استفاده از آغازگرهاي اختصاصی طراحی شده از ژن ABF4 در آرابیدوپسیس، یک قطعه cDNA به طول 689bp جداسازي، همسانه سازي و توالی یابی شد. قطعه توالی یابی شده شامل اکزون هاي شماره یک و دو بود و بیشترین شباهت را، به میزان % 78، با ژن ABF4 در آرابیدوپسیس داشت . بررسی بیان ژن ABF4 در شرایط بدون تنش و تنش رطوبتی نشان داد که میزان بیان ژن ABF4 تحت تنش رطوبتی در مقایسه با شرایط بدون تنش افزایش محسوسی داشت.
واژه هاي کلیدي: تنش خشکی، کلزا، ABF4
مقدمه
تنش، معمولا به عنوان یک عامل خارجی که باعث تاثیر منفی بر زندگی گیاه میگردد تعریف میشود - . - 8 یکی از این عوامل تنش زا ، خشکی است که بر رشد گیاه تاثیر منفی بسزایی دارد و باعث کاهش عملکرد گیاه میشود. خشکی بخصوص در مناطق خشک و نیمه خشک مهم ترین عامل محدود کنندهي رشد گیاهان میباشد - . - 2 ژنهاي زیادي درگیاهان شناسایی شدهاند که در تنشهاي مختلف از جمله خشکی القا شده و موجب افزایش تحمل گیاه میشوند. از جملهي این ژنها، میتوان به ژنهاي خانواده AREB/ABF در گیاه آرابیدوپسیس - Arabidopsis thaliana - اشاره کرد که بیان آنها وابسته به اسید آبسیزیک است و در پاسخ گیاه به تنشهاي خشکی و شوري، نقش مهمی دارند.
محصول این ژنها پروتئینهاي عامل رونویسی هستند که به نواحی پروموتري تعدادي از ژنهاي درگیر در تنش خشکی و شوري متصل شده و بیان آنها را در گیاه تنظیم میکنند - . - 3 عوامل رونویسی خانواده AREB/ABF به موتیفی به نام - ABA-responsive element - ABRE که داراي توالیC/T ACGTGGC میباشد متصل شده و بیان ژنهاي وابسته به ABA به نامهاي RD20A و RD29B را افزایش میدهند - . - 1 هر پروتئینABF شامل یک محدوده مشخص اتصال یافته به DNA از نوع bZIP می باشد و سه یا چهار تکرار 7 تایی از لوسین یا ایزولوسین نزدیک به پایانه کربوکسیلی دارد 1 - و. - 2 کلون کردن چهار cDNA مستقل براي عوامل اتصال یافته به ABRE در آرابیدوپسیس - ABF4 وABF3و ABF2 و - ABF1 گزارش شده که ABF4 وABF2 به ترتیب به نامهاي AREB2 وAREB1 نیز شناخته می شوند - 1و7و. - 9
بیان ژن ABF4 به عنوان یکی از اعضاي خانواده ABF به طور مداوم در ریشهها، روزنههاي آبی و برخی سیستمهاي آوندي بیان میشود - . - 1 بیان این ژن به وسیله تیمارهاي خشکی ، اسید آبسیزیک و شوري در بافتهاي رویشی القا میشود . - 9 - فعال شدن پروتئین ABF4 نیازمند تغییرات شیمیایی پس از رونویسی از نوع فسفریلاسیون میباشد 3 - و. - 7 گیاهان تراریخته آرابیدوپسیس که حاوي یک نسخه اضافی از ژن ABF4 هستند، تحمل بیشتري به خشکی نشان دادند - . - 4 بر اساس مطالعاتی که بر روي توالی اعضاي خانواده ABF انجام گرفت درخت فیلوژنتیکی این خانواده ترسیم گردید و مشخص شد که بیشترین همولوژي توالی مربوط به ABF1 و ABF4 می باشد . - 1 -
گیاه کلزا - Brassica napus - به علت دارا بودن ذخایر غنی اسیدهاي چرب به عنوان یکی ازمهمترین گیاهان روغنی در سطح جهان مطرح است . - 6 - خشکی از موثرترین عوامل محدود کننده مناطق تحت کشت و راندمان تولید کلزا می باشد - . - 5 ارتباط فیلوژنتیکی بسیار نزدیک آرابیدوپسیس و گونه هاي زراعی جنس براسیکا امکان بهره گیري از ژنوم توالی یابی شده آرابیدوپسیس را براي یافتن ژن هاي ارتولوگ در ژنوم کلزا فراهم می کند . - 10 - از آنجا که ژن ABF4 تا به حال فقط در گیاه آرابیدوپسیس شناسایی و جداسازي شده است، هدف از انجام این تحقیق شناسایی ژن ABF4 در کلزا با استفاده از اطلاعات توالی این ژن در آرابیدوپسیس و تعیین پاسخ بیان این ژن در واکنش به تنش خشکی است.
مواد و روشها
براي انجام این تحقیق از رقم پاییزه SLM046 کلزا استفاده شد. بذور رقم مذکور در گلخانه و تحت شرایط استاندارد کشت شدند. در مرحله 4-3 برگی از برگ گیاهان نمونهگیري شد. سپس با استفاده از کیتRNXTM - سیناژن - ، استخراج RNA از نمونه برگ انجام شد. پس از تعیین کیفیت و کمیت RNA استخراج شده، به منظور اطمینان از عدم وجود آلودگی DNA، تیمار - DNaseکیت شرکت - Fermentas بر روي RNA استخراج شده، انجام شد. اولین رشته cDNA با استفاده از کیت سنتز cDNA - شرکت - Fermentas سنتز شد. پس از همردیفی ژنهاي خانواده ABF در آرابیدوپسیس، آغازگرهاي اختصاصی براي جداسازي قطعهاي از ژن ABF4 در کلزا طراحی شدند. واکنش زنجیرهاي پلیمراز انجام شد و در نهایت محصول پی سی آر با اندازه قابل انتظار مشاهده شد. قطعه مورد نظر در پلاسمید pTZ57R/T همسانه سازي و سپس توالی یابی شد.
به منظور بررسی پاسخ بیان ژن ABF4 به تنش رطوبتی، از برگ گیاهان در شرایط بدون تنش و تحت تنش رطوبتی نمونه گیري شد. با استفاده از کیتRNXTM - سیناژن - ، استخراج RNA از نمونههاي برگ کنترل و تنش رطوبتی انجام شد. پس از تعیین کیفیت و کمیت RNAهاي استخراج شده و تیمار Dnase بر روي آنها، سنتز اولین رشته cDNA با استفاده از کیت سنتز cDNA - شرکت - Fermentas و با میزان RNA یکسان 1 میکروگرم براي هر نمونه انجام شد. با استفاده از قطعه توالییابی شده، آغازگرهاي جدیدي با هدف تکثیر قطعه اي به طول 169 جفت نوکلئوتید به منظور بررسی القاي بیان ژن ABF4 در شرایط تنش رطوبتی طراحی شدند. از ژن elongation factor 1 به عنوان کنترل داخلی استفاده شد. واکنش زنجیرهاي پلیمراز براي نمونههاي کنترل و تنش با استفاده از آغازگرهاي اختصاصی ژنهاي elongation factor 1 وABF4 انجام و فرآوردههاي بدست آمده ارزیابی شدند.
نتایج و بحث
با استفاده از آغازگرهاي طراحی شده از ژن ABF4 در آرابیدوپسیس، یک قطعه cDNA به طول 689bp جداسازي، همسانه سازي و توالییابی شد - شکل. - 1 پس از انجام جستجوي BLASTn در مقابل توالی هاي موجود دربانک ژن - GenBank - ، مشخص گردید که قطعه توالییابی شده بیشترین شباهت را به ژن AtABF4 آرابیدوپسیس، و به میزان % 78 دارد که صحت فرآیند جداسازي و همسانه سازي را مورد تایید قرار داد - شکل . - 2 با توجه به اینکه آغازگرهاي استفاده شده از اکزونهاي شماره یک و دو AtABF2 بودند، قطعه توالی یابی شده شامل اکزون هاي یک و دو بود. بر مبناي مقایسه توالیهاي ژنومی و ناحیه کد شونده - - CDS ژن ABF4 در آرابیدوپسیس، انتهاي اکزون شماره یک در قطعه ارتولوگ توالی یابی شده در کلزا تعیین شد.
در این تحقیق بیان ژن ABF4 در شرایط بدون تنش و تنش رطوبتی با روش RT-PCR مقایسه شد. واکنش زنجیره اي پلیمراز در هر دو شرایط منجر به تکثیر قطعه اي از ژن ABF4 در کلزا به طول 169 bp شد. در حالیکه ژن elongation factor 1 - elf1 - به عنوان کنترل داخلی - قطعه اي با طول - 186 bp بیان تقریبا یکسانی در هر دو شرایط نشان داد، میزان بیان ژن ABF4 در نمونه تحت تنش رطوبتی در مقایسه با نمونه کنترل افزایش محسوسی داشت - شکل . - 3 القاي بیان ژن ABF4 در شرایط تنش رطوبتی را میتوان به عنوان یک دلیل اولیه بر نقش احتمالی این ژن در ایجاد تحمل خشکی در کلزا در نظر گرفت و آن را به عنوان ژن هدف در آزمایشهاي پیشرفته و تکمیلی به کار گرفت.
