بخشی از مقاله
چکیده
- miRNA - MicroRNAها نقش مهمی را در تنظیم بیان ژنها در سطح پس از رونوشتبرداري در گیاهان بازي میکنند. مطالعات اخیر نشان دادهاند که miRNAها، در بسیاري از فرایندهاي مرتبط با تکثیر، رشد و نمو و پاسخ گیاه به تنشهاي زنده و غیر زنده نقش دارند .
در این تحقیق ژنهاي هدف miRNAهاي برنج با استفاده از روشهاي بیوانفورماتیکی شناسایی و miRNAهایی که در کنترل ژن-هاي دخیل در پاسخ به تنش خشکی نقش داشتند، مشخص شدند. سپس تغییر بیان برخی از این miRNAها با استفاده از روش qRT-PCR و آغازگرهاي Stem-Loop در شرایط تنش خشکی در مقایسه با شرایط عادي مورد بررسی قرارگرفت. miR3979، miR529 و miR444 که به ترتیب در کنترل ژنهاي دخیل در انتقال پیام اکسین، فاکتورهاي رونویسی SPL و فاکتورهاي رونویسی MADS نقش دارند، کاهش بیان معنیداري را نشان دادند.
کاهش بیان miR3979 و miR529 میتواند متعاقبا باعث افزایش بیان ژنهاي فسفوریبوزیل ترانسفراز، BTBZ1 و BIG درگیر در مسیرهاي پیام رسانی اکسین گردد. همچنین کاهش بیان miR529 و miR444 نیز میتواند به تغییر بیان برخی فاکتورهاي رونویسی SPL و MADS که در بسیاري از فرایندهاي اساسی گیاه مانند نمو نقش دارند، منجرگردد. بنابراین این miRNAها در برنج با کنترل مسیرهاي پیام رسانی هورمون اکسین و تنظیم فاکتورهاي رونویسی که خود مسئول تنظیم بسیاري از ژن-هاي پاسخ به تنش هستند، در شرایط تنش نقش خود را ایفا میکنند.
مقدمه
- miRNA - microRNAها مولکولهاي RNA کوچک تکرشتهاي غیرکدکننده و تنظیمی هستند که طولی بین 19 تا 24 داشته و نقش مهمی را در تنظیم بیان ژن در یوکاریوتها از طریق تجزیه RNA یا ممانعت از ترجمه آن ایفا میکنند miRNA . - Baulcombe 2004 - ها مانند ژنهاي کدکننده پروتئین توسط RNA پلیمراز - Pol II - 1II رونوشت برداري میشوند . - Lee, Kim et al. 2004 - رونوشت RNA تکرشتهاي در ابتدا ساختار ساقه-حلقهاي را شکل میدهد که پس از دو مرحله برش در ناحیه ساقه توسط آنزیم DCL12، تولید مولکول دو رشتهاي کوچکی با انتهاي 3´ آزاد میکند که با عنوان miRNA/miRNA* شناخته میشود
سپس این مولکول کوچک دو رشتهاي درون مجموعهاي از پروتئینها با عنوان مجموعه خاموشی القا شونده توسط - RISC - 3 RNA، وارد شده و رشته اصلی که miRNA است و از این مرحله miRNA بالغ4 نامیده میشود درون پروتئینی به نام آرگونات5 که عضو اصلی این مجموعه است قرار میگیرد و رشته مقابل حذف میشود . - Vaucheret 2008 - مجموعه خاموشی در این لحظه قابلیت شناسایی ژن هدف را داشته و بر اساس مکمل بودن بازها میان miRNA و ژن هدف به آن متصل شده و عمل ممانعت از ترجمه یا تجزیه mRNA انجام میشود
miRNAها نقش مهمی را در رشد، نمو و پاسخ به محركهاي محیطی زنده و غیرزنده ایفا میکنند - Khraiwesh, Zhu et . - al. 2012; Ehya, Monavarfeshani et al. 2013 تلاشهاي بسیاري در طی سالها منجر به شناسایی هزاران ژن شده که در پاسخ به تنشها نقش دارند و امروزه مشخص شده که برخی از این ژنها توسط miRNAها کنترل میشوند - Jung, Seo et al. . - 2009 ژنهاي هدف شناسایی شده کنونی شامل ژنهاي دخیل در بسیاري از فرایندهاي نموي گیاه نظیر تکثیر سلولی، نمو برگ و گل، گلدهی و همچنین پاسخ گیاه به تنشهاي زنده و غیرزنده میشوند
در مطالعه اي که توسط Zhu et al - 2008 - بر روي برنج به منظور بررسی بیان miRNAها در طی نمو بذر در دو مرحله 5-1 و 10-6 روز بعد از گرده افشانی انجام شد، دو miRNA در مرحله 5-1 و چهار miRNA در مرحله 10-6 افزایش بیان نشان دادند - Zhu, Spriggs et al. miRNA . - 2008هاي گیاهچههاي برنج در دو شرایط نرمال و تیمار با H2O2 مورد بررسی قرار گرفتند و هفت miRNA در شرایط تیمار H2O2 تغییر بیان نشان دادند. با بررسی ژنهاي هدف این miRNA ها مشخص شد که این ژنها در پاسخهاي سلولی و فرایندهاي متابولیکی شامل تنظیم رونوشتبرداري، انتقال مواد غذایی، تکثیر سلولی و مرگ برنامهریزي شده سلول نقش دارند
همچنین تعداد miRNA 29 جدید در بررسی miRNAهاي دخیل در طی جوانهزنی بذر برنج شناسایی شدند که در اکثر موارد افزایش بیان اینها با کاهش بیان ژنهاي هدفشان همراه بود . - Xue, Zhang et al. 2009 - در بررسی که بر روي گندم به منظور شناسایی miRNAهاي دخیل در پاسخ به تنش گرما انجام شد، یک miRNA افزایش بیان و هشت miRNA کاهش بیان نشان دادند
. - Xin , Wang et al. 2010 بیان miRNAها نه تنها در شرایط مختلف بلکه در گیاهان مختلف نیز متفاوت است و بنابراین لزوم بررسی تغییر بیان miRNAها براي هر گیاه در شرایط مختلف به صورت جداگانه ضروري است - Zhao, Liang et al. 2007; Li, Oono et al. 2008; Kong, Elling et al. 2010; Trindade, Capitão et al. . - 2010; Kantar, Lucas et al. 2011; Lu, Li et al. 2011; Wang, Chen et al. 2011 امروزه تلاشهاي بسیاري به منظور شناسایی و استفاده از miRNAها در تنظیم بیان ژنها در پاسخ به تنش خشکی انجام شده است
با توسعه تکنیکهاي نوین توالییابی، miRNAهاي زیادي در برنج شناسایی شدهاند - - Sunkar, Zhou et al. 2008 با اینحال تاکنون همه miRNAهایی که میتوانند در کنترل ژنهاي پاسخدهنده به تنش ایفاي نقش کنند مورد بررسی قرار نگرفتهاند. یکی از مهمترین راههاي شناسایی ژنهاي هدف miRNAها استفاده از روشهاي بیوانفورماتیک بر اساس مکمل بودن miRNAها و مکان اتصال آنها در ژنهاي هدف میباشد. miRNAهاي گیاهان برخلاف جانوري معمولا درجه مکمل بودن بالایی را با ژنهاي هدف خود نشان میدهند و به همین دلیل، شناسایی ژنهاي هدف در گیاهان نسبت به جانوران از دقت و صحت بالاتري برخوردار است . - Jones-Rhoades and Bartel 2004 - در این مطالعه ابتدا miRNAهایی که در کنترل ژنهاي فاکتورهاي رونویسی مهم یا ژنهاي پاسخدهنده به تنش نقش دارند با استفاده از روشهاي بیوانفورماتیکی شناسایی و سپس بیان این miRNAها در شرایط نرمال و تنش خشکی مورد بررسی قرار میگیرد.
مواد و روشها
مواد گیاهی و اعمال تیمار
در این مطالعه از ژنوتیپ IR64، تهیه شده از موسسه بین المللی برنج استفاده شد. بذور برنج پس از ضد عفونی سطحی به مدت 3 روز در دماي 30°c روي کاغذ صافی مرطوب درون پتري دیش جوانهدار شده و سپس به محیط کشت هیدروپونیک حاوي محلول یوشیدا منتقل شدند . - Yoshida, Forno et al. 1971 - محلول غذایی هر هفته تعویض شده و pH محلول روزانه اندازهگیري و در محدوده 5/5-5 تنظیم شد. شرایط نوري به صورت 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی و دماي 27°c اعمال شد. پس از دو هفته گیاهچهها به گلدانهاي حاوي دو قسمت خاك رس و یک قسمت ماسه منتقل شدند و به مدت دو هفته همه گلدانها به صورت کامل آبیاري شدند. سپس در تیمار خشکی آبیاري به مدت دو هفته متوقف شد و در این زمان در تیمار شاهد آبیاري به صورت عادي انجام گردید. بعد از دو هفته نمونهگیري از هردو تیمار انجام و نمونهها براي نگهداري بلافاصله به دماي -80°c منتقل شدند.
تجزیه و تحلیل بیوانفورماتیکی
توالی miRNAهاي بالغ از پایگاه اطلاعاتی - http://www.mirbase.org/ - miRBase گرفته شد. پایگاه آنلاین شناسایی ژنهاي هدف miRNAها - http://plantgrn.noble.org/psRNATarget - به منظور شناسایی ژنهاي هدف بالقوه استفاده شد. ژنهاي هدف پیشبینی شده براي miRNAها از نظر خصوصیات6 مورد بررسی قرار گرفته و آنهایی که میتوانستند در پاسخ به تنش نقش داشته باشند، مشخص شدند. سپس miRNAهایی که این ژنها را هدف قرار میدهند، مشخص شدند تا به منظور تغییر بیان در شرایط تنش خشکی مورد بررسی قرار گیرند.
واکنش Real-time PCR کمی و بررسی بیان miRNAها
براي انجام qRT-PCR، نمونههاي هر تیمار در ازت مایع بخوبی کوبیده شده و حدود 100 میلی گرم از آن به منظور استخراج RNA با استفاده از ترایزول - Invitrogen, CA, USA - 7 مطابق با دستورالعمل ارائه شده توسط شرکت با کمی تغییر استخراج گردید. به منظور حذف هر گونه باقیمانده DNA نمونههاي RNA استخراج شده با آنزیم دي اکسی ریبونوکلئاز 81 - Invitrogen, CA, USA - مطابق با دستورالعمل ارائه شده توسط شرکت تیمار شدند. بررسی کیفیت و کمیت RNA استخراج شده با استفاده از نانودراپ - Nanodrop technologies, W ilmington, DE, USA - ND-1000 انجام شد.
