بخشی از مقاله
چکیده
مقدمه: با وجود پیشرفتهاي زیادي که در زمینهي تشخیص و درمان HBV صورت گرفته هنوز این بیماري سالانه 400 میلیون مبتلاي مزمن دارد مرگ و میر 1میلیون نفر به طور سالانه در دنیا به سبب این بیماري نشان دهندهي اهمیت این بیماري است.
از طرف دیگر استفاده از ابزارهاي بیوانفورماتیکی در زمینهي طراحی و بهینهسازي انواع آنتیژنهاي تشخیصی رویکرد جدیدي است که میتوان با استفاده از نرمافزارها و برنامههاي متنوع، پیشبینیهاي لازم براي طراحی یک آنتیژن را به سادگی انجام داد. طراحی آنتیژن هاي چند اپیتوپی تشخیصی براي بیماريهایی مثل عفونت HBV با استفاده از این رویکرد جدید میتواند قدم مناسبی در جهت طراحیهاي هدفمندتر و کمهزینهتر باشد.
هدف:طراحی آنتیژن چنداپیتوپی براي تشخیص HBV و کلون کردن ژن آن در وکتور . PGEX4T1
روش: بررسیهاي متعدد بیوانفورماتیکی از جمله پیشبینی اپیتوپی، پیشبینی ساختارهاي دوم و سوم و بهینهسازي ساختارهاي سوم براي طراحی آنتیژن سپس سفارش ژن مورد نظر براي سنتز و در نهایت کلون کردن در وکتور
.PGEX4T1
نتیجه: با استفاده از بررسیهاي بیوانفورماتیک آنتیژن چنداپیتوپی طراحی شد و ویژگی هاي متعدد آن براي هدف شناسایی آنتیباديهاي علیه آنتیژنهاي اصلی BHV به دقت بررسی و بهینهسازي شد ودر نهایت ساختار سوم احتمالی براي آنتیژن پیشبینی و بهینهسازي گشت تا به راحتی در سیستم باکتري E.coli قابل بیان باشد. ژن مربوطه نیز به گونهاي که مناسب براي بیان در E.coli باشد طراحی و بهینهسازي گشت.در نهایت پس از سفارش ژن با موفقیت در وکتور PGEX4T1 بین دو جایگاه برش BamH1 و Xho1 کلون گشت.
مقدمه:
هپاتیتB یکی از مهمترین و رایجترین عفونتهاي ویروسی در آسیا و کشورهاي جهان سوم می باشد که حدود 2 میلیارد نفر یا به عبارتی یک سوم از جمعیت جهان در دورهاي از زندگی خود به آن مبتلا می شوند - . - Chisari and Ferrari, 1995از آنجایی که همواره خطر انتقال بیماري از طریق انتقال خون وجود دارد به دست آوردن اطلاعات در مورد حضور یا عدم حضور ویروس در خون اهدا کنندهها مقولهاي با اهمیت است
در مورد هپاتیتB روشهاي تشخیصی موجود براي آنتیباديهاي ویروس، هر یک تنها به شناسایی یک عامل میپردازد که میتواند به دلایلی مثل اینکه در برههي زمانی خاصی برخی مارکرها قابل شناسایی نیستند و یا اینکه در برخی نواحی برخی مارکرهاي بیماري قابل تشخیص نیستند مانند نمونهاي در چین میتوانند شکست بخورند
حال در رویکردي جدید می توان با استفاده از ابزارهاي بیوانفورماتیک به طراحی آنتیژن چنداپیتوپی پرداخت که چون مجموعهاي از مارکرها را به طور همزمان بررسی می کند قادر به حل کردن مشکلات روشهاي موجود باشد چنین رویکردي اخیراٌدر برخی از بیماريزاها مورد استفاده قرار گرفته که نتیجه ي خوبی در بر داشته است
استفاده از چنین روشی براي طراحی یک آنتیژن چنداپیتوپی براي HBV نیز میتواند منجر به تولید یک نامزد مناسب براي تشخیص هپاتیتB شود. در این مطالعه ما به طراحی چنین آنتیژنی از طریق بررسیهاي جامع بیوانفورماتیکی پرداخته وپس از سفارش ژن مربوطه آن را در وکتور مناسب کلون کردیم.
مواد وروشها:
.1تعیین اپیتوپها
انتخاب اپیتوپهاي خطی مورد نظر با استفاده از نرم افزارهایی مثل - Saha and Raghava, 2004 - BcePred و - Saha and Raghava, 2006 - ABCpred و مطالعات کتابخانهاي و دوختن اپیتوپها با استفاده از لینکر مناسب.
.2 پیشبینی ساختارهاي دوم و سوم و بهینهسازي ساختارهاي سوم پیشبینی ساختار دوم و سوم آنتیژن با استفاده از نرمافزارهاي متعدد : - Roy et al., 2010 - I-TASSER ، - Wu and Zhang, 2007 - LOMETS وLOOPP در پایگاه . http://cbsuapps.tc.cornell.edu/loopp.aspx سپس بهینهسازي ساختار با استفاده از رویکرد Molecular
dynamics
.3کلون کردن ژن
بهینهسازي ژن مورد نظر حاصل از توالی آنتیژن براي بیان در باکتري و سپس برش با آنزیمهاي محدود کننده به صورت ترتیبی ودر نهایت واکنش لیگیشن در وکتور PGEX4T1 براي کلون کردن و در تایید نهایی آن با کلنی .PCR
نتیجه:
با استفاده از ابزارهاي بیوانفورماتیک اپیتوپهاي مورد نظر انتخاب وپیشبینی شدند که در جمع 8 اپیتوپ خطی براي سلولهاي B انتخاب و پیشبینی شدند
شکل.1توالی اپیتوپها وترتیب چینش آنها در آنتیژن
با استفاده از نرمافزارهاي موجود ساختار سهبعدي براي آنتیژن چنداپیتوپی مشخص وپیشبینی شدند که بررسیها نشان داد که همهي اپیتوپها به خوبی در معرض قرار دارند و دسترسی آنتیباديها به آنها ممکن خواهد بود بسیاري از ویژگیهاي دیگر آنتیژن نیز مورد بررسی قرار گرفت تا مشکلی براي بیان آن گیش نیاید
شکل.2 ساختار سوم پیشبینی شده و بهینهسازي شده
در نهایت ژن مورد نظر بعد از برش با آنزیمهاي BamH1 و Xho1 در یک واکنش لیگیشن در داخل وکتور که خود با همان آنزیمها بریده شده بود قرار گرفت و در نهایت صحت آن با کانی PCR آزمون شد.
