بخشی از مقاله
چکیده
در فرمولاسیون کودهای میکروبی فسفاته کهغالباً به فرم گرانوله تهیه میشوند از باکتریهای حلکننده فسفات استفاده میشود. از جمله محدودیتهای تولید این نوع کود، از بین رفتن باکتریها در فرایند تهیه و خشک نمودن گرانولها میباشد. بر این اساس در این تحقیق، اقدام به جداسازی باکتریهای حلکننده فسفات مقاوم به دما شد، و تحمل دمایی و توانایی انحلال فسفات - از منابع سنگ فسفات و تریکلسیم فسفات - در 9 باکتری جدا شده از خاکهای بومی مورد ارزیابی قرار گرفت. از پنج باکتری - جدایههای RPS4، RPS6، RPS7، RPS8 و - RPS9 با قابلیت تولید هاله شفاف تنها دو باکتری RPS7 - و - RPS9 قادر به تحمل دمای 55 درجه سانتی گراد بمدت 16ساعت بودند . در انحلال فسفات کممحلول باکتری RPS4 و RPS9 به ترتیب با دارا بودن مقدار 559/7 و 531/8 میلیگرم بر لیتر بیشترین میزان حلکنندگی را از خود نشان دادند. نتایج زندهمانی نیز نشان داد که زندهمانی جمعیت میکروبی در حالت بدون تیمار دمایی تا 6 ماه و در حالت تیمار دمایی به 4 ماه کاهش یافت. شناسایی مولکولی RPS7 و RPS9 حاکی از آن بود که هر دو جدایه متعلق به گونه Pantoea agglomerans هستند.
واژههای کلیدی: کود میکروبی فسفاته، باکتریهای حلکننده فسفات، مقاوم به دما
مقدمه
فسفر یکی از عناصر مهم و ضروری برای گیاهان است. برای تأمین فسفر مورد نیاز از کودهای فسفره استفاده میشود که در شرایط خاک، بهصورت نامحلول درآمده و از دسترس گیاه خارج میشود. تولید بیشتر محصولات از چالشهای اصلی کشاورزی است. مصرف بیرویه کودهای فسفاته، گذشته از هزینههای ارزی گزاف برای خرید کود از خارج کشور، اثرات زیانباری نیز به دنبال دارد. از جمله این اثرات میتوان به بهمخوردن تعادل عناصر غذایی، کاهش عملکرد محصول، تجمع بور در گیاه در حد سمیت، کاهش جذب مس، غیرمتحرک شدن آهن در خاک، ممانعت از جذب آهن توسط ریشه، مختل کردن متابولیسم روی درون گیاه، کاهش میکوریزایی شدن ریشه، آلودگی خاک به کادمیوم، تنزل کیفیت محصول، ازدیاد بار منفی خاک و آلودگی آبها به فسفر و بروز پدیده اتروفیکاسیون اشاره نمود - خاوازی و ملکوتی . - 1380
به همین دلیل امروزه عملیات کشاورزی به سمت روشهای پایدارتر و سازگار با محیطزیست سوق پیداکرده است . - Leach and Mumford, 2008 - بروز مشکلات اقتصادی و زیستمحیطی ناشی از مصرف بیرویه کودهای شیمیایی و نیز توجه به قابلیتهای ذاتی بسیار جالب و متنوع موجودات خاکزی و بهویژه میکروارگانیسمها موجب گردیده که یکی از مهمترین و کاربردیترین زمینههای تحقیقاتی در مطالعات علمی روز، تلاش برای تولید کودهای زیستی باشد.کودهای زیستی یکی از مهمترین اجزاء کشاورزی آلی و پایدار محسوب میشوند که استفاده صحیح از آنها میتواند ضمن افزایش عملکرد کمی و کیفی محصولات کشاورزی، کاهش مصرف بعضی از انواع کودهای شیمیایی و در نتیجه حفظ محیط زیست را نیز به دنبال داشته باشد - سلیم پور و همکاران . - 2010
کودهای میکروبی نیز نوعی از کودهای زیستی هستند که در آن بر بستری از مواد آلی- معدنی از میکروارگانیسمهای مفید بهره برده میشود. یکی از کودهای میکروبی مهم، کود میکروبی فسفاته میباشد که با توجه به اهمیت فسفر به عنوان یکی از عناصر غذایی پرمصرف برای محصولات کشاورزی، استفاده از آن مورد توجه است - ناظری و همکاران . - 2010 کود میکروبی فسفاته ممکن است به صورت پودری یا گرانوله استفاده شود که در فرایند گرانولسازی، بایستی پس از اختلاط اجزاء تشکیلدهنده ممکن است از حرارت ملایم جهت خشک نمودن کود تولیدی استفاده شود، همچنین این نوع کود به دلیل دارا بودن رطوبت اندک - حدود - %4 شرایط برای بقا باکتری نامناسب است.
چنین شرایطی باعث از بین رفتن باکتریهای افزوده شده به بستر خواهد شد. بدین خاطر روشهای متنوع و ابتکاری برای گذر از این مرحله مد نظر قرار میگیرد. در این پژوهش ضمن جداسازی، ارزیابی چندین باکتری مختلف مد نظر قرار گرفت، تا علاوه بر اندازهگیریهای انحلال فسفات در محیط اسپربر جامد و مایع در حضور منابع مختلف فسفر - سنگ فسفات و تریکلسیم فسفات - ، تراکم جمعیت باکتری و ماندگاری آن بر بستر سنجیده شود. ضرورت دستیابی به یک گونه میکروبی کارآمد با زمان ماندگاری بالا و قابلیت کاربرد بعنوان کودهای میکروبی فسفاته گرانوله موضوع این تحقیق است و ضرورت پرداختن به آن احساس میشود. در حال حاضر این نوع از باکتریها کمتر در دسترس میباشند و تحقیقات اندکی در این زمینه صورت گرفته است، لذا در این تحقیق به این جنبهها پرداخته شده است.
مواد و روشها جداسازی باکتریهای حلکننده فسفات مقاوم به دما
ابتدا بر روی خاکهای نمونهبرداری شده تیمار دمایی اعمال شد - دمای 55 درجه سانتیگراد بمدت 16 ساعت - و سپس سریهای رقت آنها تهیه شد و از چهار رقت پایانی - رقت 10- 9، 10-8، 10-7 و - 10-6 در 2 تکرار به میزان 100 میکرولیتر بر روی محیط جامد اختصاصی Sperber انتقال داده شد. بعد از گسترده نمودن سوسپانسیون میکروبی از رقتهای موردنظر در محیط کشت جامد اسپربر و ظاهر شدن کلنیها، غربالگری بر اساس مقاومت به تیمار دمایی اولیه خاکها و در ادامه توانایی رشد در محیط اسپربر جامد، انحلال فسفات کم محلول - تشکیل هاله شفاف - ، فنوتیپ و ریخت کلنی باکتریها اقدام به جداسازی باکتریها شد.
اعمال تیمار دمایی
ارزیابی تحمل دمایی - تیمار دمای 55 درجه سانتیگراد به مدت 16 ساعت - باکتریها در سه مرحله انجام گرفت. الف: تیمار دمایی اولیه روی خاکهای نمونهبرداری شده، ب: کشت خالص باکتری، در این حالت از هر جدایه کشت خالصی تهیه شد و سپس کشت نقطهای از آن در محیط اسپربر جامد تهیه شد و ج: باکتری افزوده شده به بستر، پس از تامین جمعیت میکروبی اولیه مناسب - 107 - در بستر میکروبی تهیه شده - بر پایه خاک فسفات 45 - گرم - + گوگرد 15 - گرم - + باگاس 30 - گرم - - ، شمارش جمعیت میکروبی و زندهمانی ارزیابی شد.
شمارش تعداد باکتری و بررسی زندهمانی باکتری
با توجه به اینکه تعداد جمعیت میکروبی فعال و زنده در مایه تلقیح میکروبی بایستی منطبق بر استانداردهای حاکم بر محصولات زیستی باشد، بدین منظور برآورد و شمارش میکروبی به عنوان یکی از پارامترهای مهم در کودهای میکروبی مورد بررسی قرار گرفت. کود میکروبی تهیه شده به دو صورت مورد شمارش میکروبی قرار گرفت - الف: نیمی از کود نمونه، با حفظ شرایط اولیه در دمای معمولی نگهداری شد ب: نیم دیگر پس از تحمل دمای 55 درجه سانتیگراد به مدت 16 ساعت، تعیین جمعیت شد - . برای مشخص نمودن جمعیت میکروبی، ابتدا سریهای رقت تهیه شد و از رقتهای پایانی - رقت 10-6، 10- 5، -4 10 و - 10- 3 در 2 تکرار به میزان 100 میکرولیتر بر روی محیط اسپربر جامد انتقال داده شد . - Motsara and Roy 2008 - برای تهیه اولین رقت 10 - 10-1 - گرم از کودهای میکروبی تهیه شده به 90 میلیلیتر آب مقطر استریل افزوده شد و سایر رقتها تا رقت 10-6 در لوله های حاوی 9 میلیلیتر آب مقطر استریل با انتقال 1 میلیلیتر از سوسپانسیون میکروبی تهیه شد. شمارش جمعیت در زمان شروع آزمایش - صفر - ، 2، 4 و 6 ماه بعد از تلقیح بر روی نمونهها انجام گرفت.
آزمون نیمهکمی توان حلکنندگی فسفات معدنی نامحلول
برای انجام این آزمون از محیط کشت - Sperber 1958 ; Motsara and Roy 2008 - Sperber استفاده شد که در این محیط به ترتیب از منابع فسفر نامحلول یعنی تریکلسیم فسفات و سنگ فسفات به عنوان تنها منبع فسفر استفاده شد. برای هر باکتری یک ظرف پتری در نظر گرفته و سطح هر پتری به سه قسمت مساوی تقسیم شد، مرکز هر قسمت با 5 میکرولیتر از سوسپانسیون باکتری تلقیح گردید، ظروف پتری تلقیح شده درون انکوباتور با دمای 28 درجه قرار داده شدند. تمامی پلیتها در سه نوبت 3، 5، 7 و 12 روز پس از تلقیح از انکوباتور خارج شده و قطر کلنی رشد یافته - Colony Diameter - و نیز قطر هاله شفاف حاصل از انحلال فسفات - HD - به دقت اندازهگیری شد، متوسط نسبت قطر هاله به قطر کلنی - HD/CD - در روز دوازدهم برای هر جدایه محاسبه گردید. در استفاده از سنگ فسفات هیچ هالهای قابل تشخیص نبود بدین خاطر نتایج آن آورده نشده است.
آزمون کمی توان حلکنندگی فسفات معدنی نامحلول
در این مرحله برای بررسی دقیقتر میزان حلکنندگی فسفات هر باکتری با سه تکرار در محیط کشت اسپربر مایع کشت شد. ارلنهای حاوی محیط مایع تلقیح شده و نمونه شاهد در شیکر انکوباتور در تاریکی و با دمای 28 با شیک 120 دور در دقیق به مدت 144 ساعت قرار گرفتند. از سوسپانسیونهای حاصل مقدار 2 میلیلیتر برداشته و پس از 5 بار رقیقسازی با آب مقطر - حجم نهایی 10 میلیلیتر - در دور 5000rpm و به مدت 10 دقیقه سانتریفیوژ گردید. در این مرحله سلولهای باکتری، ذرات معلق و فسفات نامحلول به کمک سانتریفوژ از سوسپانسیون جمعآوری و مقدار فسفر محلول در مایع صاف رویی به روش وانادات-مولیبدات اندازهگیری شد . - Anonymous 1980 - آزمون انحلال فسفات در حضور هر دو منبع فسفر - تریکلسیم فسفات و سنگ فسفات - به صورت جداگانه بررسی شد.
شناسایی
برای شناسایی باکتریها به روش مولکولی 16S rRNA از آغازگرهای عمومی 27F و 1492R استفاده شد - Sarikhani . - et al., 2013
نتایج و بحث غربالگری دمایی و انحلال فسفات کم محلول
از نمونه خاکها 9 کلنی باکتری با فنوتیپ مختلف بر روی محیط جامد اسپربر قادر به رشد بودند که از میان آنها تنها 5 باکتری قادر به تشکیل هاله شفاف - جدایههای RPS4، RPS6، RPS7، RPS8 و - RPS9 بودند. از بین این 5 جدایه نیز بعد از کشت به روش نقطهگذاری در محیط اسپربر جامد و اعمال تیمار دمایی، تنها دو باکتری RPS9 و RPS7 قادر به رشد و زندهمانی تحت دمای 55 درجه سانتیگراد بمدت 16 ساعت بودند. فرض آزمایش بر آن است که در فرایند تولید کود میکروبی چنین دمایی در این مدت زمانی باعث ایجاد تنش دمایی و خشکی شود. به این خاطر این تیمار دمایی در آزمایش لحاظ شد.
توان حلکنندگی فسفات نامحلول باکتریهای بکاررفته درکودهای میکروبی آزمون نیمهکمی توان حلکنندگی فسفات معدنی نامحلول
اندازهگیری قطر هاله شفاف حاصل از انحلال فسفات معدنی نامحلول از دو منبع فسفات کممحلول - تریکلسیمفسفات و سنگ فسفات - و محاسبه متوسط نسبت قطر هاله به قطر کلونی - HD/CD - مشخص کرد که در محیط اسپربر تریکلسیمفسفات، باکتری RPS4 ، RPS9 و RPS7 به ترتیب با دارا بودن مقدار 2/78 ، 2/60 و 2/27 برای نسبت - HD/CD - بعد از گذشت 12روز قدرت بالایی در امر انحلال فسفات معدنی نامحلول داشتند و دو باکتری RPS8 و RPS6 به ترتیب با دارا بودن نسبتهای 1/94 و 1/57، در رتبههای بعدی قرار گرفتند. در محیط کشت اسپربر سنگ فسفات هیچ هالهای مشاهده نشد - شکل . - 1
