بخشی از مقاله
چکیده: لوان نوعی پلی فروکتان است که از واحدهای فروکتوفورانوزیل با پیوند های 6 - و- - 2 تشکیل شده است و به دو شکل لوان گیاهی و میکروبی از سوبسترا های بر پایه ساکارز و رافینوز توسط آنزیم Levansucrase تولید می شود. در این تحقیق به منظور کاهش هزینه و صرفه اقتصادی از شیره انگور حاصل از ضایعات انگور به عنوان محیط تخمیر و منبع کربنی برای تولید صمغ لوان از باکتری باسیلوس سوبتلیس و همچنین از ساکارز خالص به عنوان شاهد استفاده گردید و فاکتورهای مختلفی از جمله تغییرات pH، تغییرات عدد جذب، جرم سلولی و مقدار لوان تولیدی بررسی شد و مشخص گردید که با گذشت زمان pH محیط کاهش و عدد جذب به دلیل افزایش کدورت در اثر تولید متابولیتهای میکروبی افزایش می یابد. نتایج نشان داد با گذشت زمان و کاهش pH، تولید صمغ کاهش می یابد. کروماتوگرافی لایه نازک نیز بیانگر تولید و حضور لوان در محیط حاوی شیره انگور و ساکارز بود .
مقدمه
فروکتان یکی از فراوانترین هموپلی ساکارید های طبیعت است که از واحد های -D فروکتوفورانوزیل تشکیل شده است. دو نوع فروکتان با نام های لوان و اینولین با توجه به نوع پیوند موجود بین واحد های سازنده آن وجود دارد . لوان نوعی پلی فروکتان است که از واحدهای فروکتو فورانوزیل با پیوند های 6 - و- - 2 تشکیل شده است - Han 1990a - و تعدادی هم پیوند های 1 - و- - 2 در شاخه های جانبی آن دیده می شود. پلی فروکتان دوم اینولین است که خود به دو دسته اینولین گیاهی و اینولین میکروبی تقسیم می شود. اینولین گیاهی که بیشتر از سبزیجات و گیا هان و اینولین میکروبی از باکتری های Stereptocucus mutans و Stereptocucus sanguis که از پاتوژن های انسانی هستند ایزوله می شوند.
لوان نیز به دو شکل لوان گیاهی و به عنوان ماده خارج سلولی میکروارگانیسم ها یافت می شود. لوان گیاهی از تعداد واحد های کمتری - 10-200 - تشکیل شده اما وزن مولکولی نوع میکروبی آن به میلیونها دالتون می رسد. لوان بیشتر از باکتری های Bacillus subtilis، Zymomonas mobilis، Bacillus polymyxa، Aerobacter levanicum و Pseudomonas به عنوان ماده خارج سلولی از سوبسترا های بر پایه ساکارز و تا حدی رافینوز توسط آنزیم Levansucrase تولید می شود که ساکارز خالص منبع بهتری برای تولید لوان می باشد . - Shih et al., 2005 - این آنزیم - Levansucrase - نوعی ترانسفراز است - sucrose: 2,6- -D fructan Corrigan 1979, Dedonder 1966, Dias and Bhat 1962, - 6-D fructostransferas, sucrose 6-fructosyl-transferas, EC 2,4,1,10 - - Hestrin et al., 1943, Jang et al., 2001, Shimamura et al 1987 and Tanaka et al., 1979 که اولین بار توسط شخصی به نام Hestrin در سال 1943 نامگذاری شد و ساخت لوان از ساکارز را بر عهده دارد .
- Han and Clarke 1990b - بسیاری از الیگو ساکارید ها و پلیساکارید ها به عنوان مواد جایگزین و رقیب برای لوان مطرح هستند از جمله مانان، پولولان، زانتان، اینولین که مهمترین آن ها اینولین می باشد. اینولین به دلیل داشتن ساختار فیبری در دمای اتاق در آب حل نمی شود اما لوان در دمای اتاق در آب قابل حل است . لوان ویسکوزیته بالایی دارد به ه مین دلیل بازیافت آن کار سختی می باشد.
مقدار لوان تولیدی به نوع میکروارگانیسم بستگی داشته که میزان آن تقریبا کم است. بازده تولید در تئوری حدود %50 میباشد که به میزان ساکارز نیز بستگی دارد. لوان و مشتقات آن از جمله لوان هپتوز منبع کربن برخی از میکروفلور های روده از جمله بیفیدیوباکتر ها، لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس و... میباشند. همچنین به دلیل داشتن فیبر اثرات بیولوژیکی و بیوشیمیایی مفیدی داشته و موجب کاهش کلسترول و تریگلیسیریدها در خون می شود.
لوان نقش پایدار کننده و غلیظ کننده در سیستم های غذایی دارد و امروزه در صنعت لبنیات به منظور بهبود بافت محصولات لبنی تخمیری از جمله ماست و پنیر استفاده می شود . - Han 1990a and Jang et al., 2001 - اگرچه لوان یک صمغ محلول در آب است اما کاربرد آن به دلیل سیالیت کمی که دارد محدود می باشد. به منظور گسترش کاربرد های لوان باید از روش های بیوسنتز جدید به کشف آنزیم های نوین برای تولید لوان با وزن مولکولی مناسب پرداخته شود .
قیمت بالای منبع کربن محیط کشت تخمیر از جمله قندهای گلوکز، فروکتوز و ساکارز اثر مستقیمی بر هزینه صمغ تولیدی دارد که این عامل، از جمله عوامل محدود کننده تولید صنعتی صمغ ها به شمار می آید. بنابراین یافتن منابع کربنی ارزان قیمت برای کاهش هزینه های تولید امری ضروری می - باشد. محصولاتی از قبیل خرما، انجیر، انگور و ... از جمله محصولات تجاری ارزشمندی است که به مقدار زیادی در کشور ها تولید می شود اما صنایع فراوری آنها هنوز رشد نکرده است . - Hacking et al., 1983 - در شرایط نامساعد جوی و نیز روش های غلط برداشت محصول، بسیا ری از محصولات از جمله انگور دچار آسیب و له شدگی می گردند. به همین دلیل در این پژوهش نیز سعی شده است تا از انگور های ضایعاتی به منظور تولید شیره انگور به عنوان محیط کشت باکتری باسیلوس سوبتلیس جهت تولید صمغ لوان استفاده شود .
مواد و روشها
.1 فعال سازی باکتری باسیلوس سوبتلیس
تولید صمغ میکروبی لوان در دو مرحله کلی انجام گرفت که در مرحله نخست میکروارگانیسم های باسیلوس سوبتلیسی که در محیط آگار رشد کرده بودند وارد محیط نوترینت براث استریل شده نموده و به مدت 24 ساعت در دمای 25 درجه سانتیگراد گرمخانهگذاری شده و به این ترتیب میکروارگانیسم فعال گردید - . - Onsoyen 1996 سپس 10 میلی لیتر از محیط دارای میکروارگانیسم فعال شده را به یک ارلن مایر 500 میلی لیتری حاوی محیط فعال سازی استریل شده در اتوکلاو در دمای 121 درجه سانتیگراد به مدت 20 دقیقه - محیط فعال سازی شامل پپتون، عصاره مخمر، گلوکز و NaCl است - اضافه کرده و در داخل شیکر بن ماری در 220 rpm در دمای 37 درجه سانتیگراد قرار داده شد .
هر 24 ساعت یکبار جذب نور با دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج 550 نانومتر خوانده شده تا عدد جذب به بیش از 0/6 برسد. در مرحله دوم مقدار 4 میلی لیتر از محیط ذکر شده را که از لحاظ تعداد و رشد میکروارگانیسم ها مناسب بوده به 40 میلی لیتر محیط تخمیر که شامل شیره انگور می باشد تزریق گردید همچنین در این تحقیق از محیط حاوی ساکارز به عنوان محیط شاهد استفاده شدسپس. محیط تخمیر مجدداً در دستگاه شیکر بن ماری در دمای 37 درجه سانتیگراد قرار داده و ابتدا با گذشت 12 ساعت و بعد هر 24 ساعت یکبار نمونه برداری انجام شد.
- Saude and Junter, 2002 - بدین ترتیب که ابتدا محیط تخمیر مورد نظر در شرایط استریل به مدت ده دقیقه سانترفیوژ - 5000× g - گردید و رسوب حاوی سلول های میکروبی به صورت رسوب در ته ظرف جداسازی شد و به مایع رویی باقی مانده به نسبت سه برابر متانول %96 اضافه گردید و به مدت 4 ساعت در دمای 4 درجه سانتیگراد نگهداری گردید. در مرحله بعدی مایع جدا شده مجدداً به منظور جداسازی صمغ لوان سانترفیوژ شد. لازم به ذکر است که برای استخراج صمغ از محیط تخمیر ابتدا به منظور غیر فعال سازی میکروارگانیسم ها و کاهش ویسکوزیته محیط در 85 درجه سانتیگراد به مدت 20 دقیقه حرارت داده شد.
.2 آماده سازی محیط تخمیر
به منظور آماده سازی محیط تخمیر ابتدا بریکس شیره انگور با افزودن مقدار کافی آب مقطر از 68 به 10 رسانده شده و پس از افزودن عصاره مخمر و NaCl در اتوکلاو استریل گردید. این مراحل برای آماده سازی محیط شاهد نیز انجام شد.
.3 بررسی شرایط لازم جهت تولید صمغ لوان
به منظور تعیین بهترین شرایط تولید فاکتور های مختلفی ارزیابی گردید . ابتدا قبل ا ز هر بار نمونه برداری pH محیط تخمیر به کمک دستگاه pH meter اندازه گیری شد و تغییرات آن به طور پیوسته ثبت گردید . به منظور بررسی کدورت محیط تخمیر که نشانی از حضور و فعالیت باکتری ها می - باشد به طور منظم عدد جذب در 550 نانومتر توسط دستگاه اسپکتوفتومتر خوانده شد . همچنین به منظور اندازه گیری مقدار لوان تولیدی، صمغ حاصل از دومین سانترفیوژ توسط خشک کن انجمادی خشک گردیده و توسط ترازوی دیجیتال وزن گردید . در این تحقیق جرم سلولی ه م تعیین گردید به این منظور از رسوب حاصل از مرحله اول سانترفیوژ استفاده شد.
.4 آنالیز ساختاری صمغ لوان توسط کروماتوگرافی لایه نازک - TLC -
به منظور شناسایی و تأیید تولید صمغ لوان تست TLC انجام گرفت. نخست نمونه %3 لوان - حجمی- حجمی - توسط اسید کلریدریک 0/1 نرمال در دمای 90 درجه سانتیگراد به مدت 3 ساعت هیدرولیز اسیدی شد و نمونه حاصل جهت کرو ماتوگرافی مورد استفاده قرار گرفت . در این تست از محلولهای قندی %3 گلوکز، فروکتوز و ساکارز به عنوان شاهد استفاده شد . نمونه ها بر روی صفحات از جنس سیلیکاژل لکه گذاری گردید و تا ارتفاع یک سانتیمتری در تانک حلال حاوی ایزوپروپیل الکل در آب به نسبت 1 به 4 قرار داده شد. بعد از رسیدن جبهه حلال به ارتفاع 3 سانتیمتری از بالای صفحه، آن را از تانک خارج نموده و پس از خشک کردن، توسط شناساگرهای شامل یک میلی لیتر نیترات نقره در صد میلی لیتر آب و محلول 0/5 مولار تیوسولفات سدیم محل لکه ها شناسایی گردید . - Eilish et al., 2006 -
.5 تجزیه و تحلیل آماری
کلیه تستهای انجام شده در سه تکرار و آنالیز آنها با نرم افزار SAS 9.1 و آزمون دانکن در سطحp< 0 .05 انجام شد.
نتایج و بحث
.1 تعیین شرایط بهینه تولید صمغ لوان
سینتیک رشد باکتری و تولید صمغ میکروبی لوان در یک سیستم تخمیر ناپیوسته آزمایشگاهی انجام شد . دمای سیستم در 37 درجه سانتیگراد کنترل گردید. نتایج حاصل از تعیین pH محیط نشان داد که با گذشت زمان به علت تولید اسید و سایر متابولیت ها توسط باکتری مقدار pH روبه کاهش است - شکل . - 1 تعیین عدد جذب محیط تخمیر در طول موج 550 نانومتر نشان داد که با گذشت زمان به علت تولید متابولیت های میکروبی و در واقع تولید صمغ کدورت محیط و عدد جذب افزایش می یابد.
لازم به ذکر است که با گذشت زمان و عدم تولید صمغ توسط باکتری کدورت مح یط به علت حضور جرم سلولی همچنان زیاد می باشد. همچنین بررسی رسوب حاصل از سانترفیوژ نشان داد که با گذشت زمان تعداد سلول های میکروبی - جرم سلولی - در ابتدا افزایش و سپس کاهش پیدا کرد که به نظر می رسد این کاهش ناشی از تولید متابولیت های سمی توسط میکروارگانیسم، تولید اسید و کمبود مواد تغذیهایی باشد.
