بخشی از مقاله
چکیده:
بیماري جاروك لیموترش Witches’ broom disease of acid lime - WBDL - یکی از مخربترین بیماريهاي باکتریایی درخت لیموترش در مناطق گرم جنوبی کشور ایران است که به وسیله Candidatus Phytoplasma aurantifolia ایجاد میشود. روشهاي سنتی از قبیل کنترل ناقلین و اقدامات قرنطینهاي، قابلیت محدودي در کنترل این بیماري دارند. بنابراین استفاده از تکنولوژيهاي نوین براي تشخیص به موقع بیماري جهت کاهش خسارات پیش رو میباید در نظر گرفته شود. در این راستا آنتیباديهاي نوترکیب میتوانند به عنوان راهکاري مناسب استفاده شوند. در این تحقیق از تکنیکهاي موثر، دقیق، سریع و ارزان نانوتکنولوژي براي تشخیص زودهنگام عامل بیماريزا استفاده شده است.
آنتیژن Immunodominant membrane protein - IMP - فیتوپلاسما عامل جاروك لیمو ترش که یک پروتئین چندکاره و ضروري جهت ایجاد بیماري در گیاه است، به عنوان هدف، جهت شناسایی بهوسیله آنتیباديهاي پلیکلونال پوشش داده شده در سطح نانوذرات کوانتومی در نظر گرفته شده است. در این راستا، ابتدا آنتیباديهاي پلیکلونال علیه فیتوپلاسماي عامل جاروك لیمو ترش تولید شده و سپس در اطراف نقاطکوانتومی چیده شدند. همچنین، آنتیژن IMP نیز به ماده رنگی ردامین - گیرنده نور - اتصال داده شد و در نهایت کمپلکس دهنده-گیرنده در سیستمFluorescence Resonance Energy Transfer - FRET - به ترتیب -QD آنتیبادي-- IMP ردامین آمادهسازي شد.
در این سیستم زمانی که نمونه مورد آزمایش آلوده به IMP بود، سبب جایگزین شدن IMP آزاد با IMP متصل شده با ردامین شد. نتیجه این جایگزینی افت پیک نمودار بود. این در حالی است که نمونه سالم به دلیل فقدان IMP تغییري در پیک نمودار ایجاد نکرد. حسگر زیستی ارائه شده صد در صد اختصاصی و قادر به تشخیص غلظت هاي بسیار پایین عامل بیماري در نمونه 5 - فیتوپلاسما در هر ماکرولیتر عصاره - بود. همچنین بر پایه نتایج آنالیزهاي FTIR، پایداري قابل ملاحظهاي را دارا می باشد. تا به حال گزارشی از تهیه این نانوبیوسنسور براي شناسایی فیتوپلاسما ارائه نشده است.
کلمات کلیدي: بیماري جاروك لیموترش، Candidatus Phytoplasma aurantifolia، پروتئین پوششی فیتوپلاسما - IMP - ، نقاطکوانتومی، سیستم FRET
مقدمه:
تشخیص بیماري مخرب جاروك لیمو ترش - WBDL - در درختان آلوده، توسط میکروسکوپ الکترونی، روش هاي سرولوژیکی - مثلا - DAS-ELISA و Real Time PCR قابل انجام است . - 1 - علاوه بر این، هیبریداسیون DNA، روش مهم و مناسبی در شناسایی وجود قطعه DNA مورد نظر در نمونه آزمایشی میباشد که کاوشگرهاي رادیواکتیو و غیر رادیواکتیو را به کار می گیرد. از روش واکنش زنجیرهاي پلیمراز - PCR1 - نیز که تکثیر قطعه مورد نظر را به عهده دارد، جهت شناسایی قطعه هدف استفاده میشود لیکن در این روشها نیاز به آمادهسازي DNA بوده و همچنین تهیه پرایمرهاي مورد نیاز با اختصاصیت بالا و قابل دسترس از جمله موارد قابل توجه دیگر می باشد .
این تکنیک ها همگینیازمند زمان و هزینه نسبتاً بالایی است.تکنیک Real time PCR نیز که تجزیه و تحلیل سریع دادهها را فراهم میسازد، روشی گران بوده و نیازمند نیروي کار ماهر میباشد. روشهاي سادرنبلات و وسترن بلات نیز به ترتیب جهت شناسایی قطعات DNA و پروتئین اختصاصی میباشند. اگرچه به طور کلی این روشها از جمله تکنیکهاي اصلی و پایه در آزمایشگاه میباشند، اما به دلیل اهمیت سرعت تشخیص عوامل بیماريزا، حرکت به سوي بکارگیري تکنولوژيهاي نوین در اصلاح روشهاي فوق و ارائه روشهاي برتر جهت جایگزینی با آنها اجتناب ناپذیر می باشد. از جمله علوم به روز دنیا علم نانوتکنولوژي میباشد که امروزه عملیات تحقیق و تشخیص بیماري را بسیار آسان، سریع و دقیق کرده است.
تفاوت اصلی فناوري نانو با دیگر فناوريها در مقیاس مواد و ساختارهایی است که در این فناوري مورد استفاده قرار میگیرند. البته تنها کوچک بودن مد نظر نیست، بلکه زمانی که اندازه مواد در این مقیاس قرار میگیرد، خصوصیات ذاتی آنها از جمله رنگ، استحکام، مقاومت در برابر خوردگی و غیره تغییر می یابد. در حقیقت اگر بخواهیم تفاوت این فناوري را با فناوريهاي دیگر به صورت قابل بیان ارزیابی کنیم، میتوانیم وجود عناصر پایه را به عنوان یک معیار ذکر کنیم. عناصر پایه در حقیقت همان عناصر نانومقیاسی هستند که خواص آنها در حالت نانومقیاس با خواصشان در مقیاس بزرگتر فرق میکند . - 2 -
اولین و مهمترین عنصر پایه، نانو ذره است. منظور از نانو ذره، ذراتی با ابعاد نانومتري در هر سه بعد است. نانوذرات میتوانند از مواد مختلفی مانند نانوذرات فلزي، سرامیکی و غیره تشکیل شوند . - 2 - از متداولترین نانوذرات میتوان به نانوذرات نیمهرسانا، کوانتومی، نانوذرات سرامیکی، نانوکامپوزیتهاي نانوذرهاي سرامیکی، نانوذرات فلزي، نانوکامپوزیتهاي فلزي اشاره کرد . - 3 - نقاط کوانتومی Quantum dots، نانوذراتی با خصوصیات منحصر به فرد هستند که کاربردهاي بالقوهاي در علوم زیستی و مشاهده وقایع درون سلول دارند. این نانوذرات، عموماًینمههاديهایی از جنس سلنیدکادمیم بوده که به وسیله یک پوسته نیمه هادي دیگر از جنس سولفیدروي پوشیده شدهاند و توانایی نشر نورهایی با رنگهاي مختلف را دارند، که رنگ نور به اندازه کریستال آنها بستگی دارد .
مادهاي که براي هسته انتخاب میشود، متناسب با طول موج مورد نظر است، به طوري که سولفیدکادمیم براي نشر نورهاي UV، سلنیدکادمیم براي نشر نورهاي مرئی و تلوریدکادمیم براي نشر طیف مادون قرمز استفاده میشود. هسته و پوسته به وسیله لایهاي پلیمري پوشیده می شوند، که این لایه مشابه سپري براي جلوگیري از سمیت سلولها به وسیله کادمیم است. مولکولهایی نظیر آنتیباديهاي مونوکلونال و همچنین مولکولهاي بزرگ مانند پروتئینها یا رشتههاي DNA میتوانند به این لایه پلیمري متصل شوندو به این صورت میتوان از آنها براي شناسایی و ردیابی بیماريهاي درون بدن موجودات زنده استفاده کرد .
مواد و روش ها:
در ساخت نانوبیوسنسور جهت تشخیص عامل بیماري جاروك لیموترش Candidatus Phytoplasma aurantifolia مراحل ذیل انجام گردیدند:
.1تزریق آنتیژنهاي اختصاصی به خرگوش جهت تولید آنتیباديهاي پلیکلونال:
ابتدا ژن تولید کننده پروتئین سطحی IMP استخراج و در پلاسمید PET28 باکتري E.coli سویهBL21 کلون شده و آنتیژن مربوطه استحصال میشود. جهت تولید آنتیباديهاي پلیکلونال شش مرحله تزریق به خرگوشها صورت میگیرد. تعیین رقت - titration - آنتیباديهاي پلیکلونال توسط آزمون ELISA بعد از هر بار خونگیري به فواصل زمانی دو هفته از هر تزریق انجام خواهد شد . - 2 -
.2 تولید نقاط کوانتومی:
نانو ذرات کوانتومی به صورت محلول در آب و با استفاده از نمک تلوریوم و کادمیم - به عنوان اجزاي هسته - و - TGA - TioGlycolicAcid به عنوان احیا کننده سنتز شد . - 4 -
.3 اتصال آنتی بادیهاي پلی کلونال در سطح نقاط کوانتومی:
محلول آنتی بادیهاي پلی کلونال و محلول نقاط کوانتومی مخلوط شده تا اتصال حاصل شود.
.4 اتصال آنتی ژن IMP به :Rodamin
براي ایجاد سیستم FRET جهت شناسایی آنتیباديهاي پلیکلونال، نیاز به گیرنده فلورسنس نقاط کوانتومی میباشد. در ابتدا سطح آنتیژن IMP با Rodamin پوشانده میشود - 5 - مقدار Rodamin - گیرنده فلورسنس نقاط کوانتومی - مورد استفاده جهت پوشاندن سطح آنتیژن IMP بر اساس فرمول زیر محاسبه گشت و این واکنش در حضور احیاکننده NaBH4 به مدت یک ساعت انجام گشت:
مول پروتئین سطحی × IMP تعداد اسید آمینه لیزین پروتئینIMP
.5. آزمون واکنشهاي مورد انتظار با سیستم :FRET
Rodamin متصل به آنتیژن IMP نقش گیرنده و نقاط کوانتومی متصل به آنتیباديهاي پلیکلونال در نقش دهنده انرژي هستند. هنگام اضافه کردن آنتیژن IMP خالص - موجود در عصاره نمونه مشکوك به آلودگی - به محلول قبلی، عمل جایگزینی آنتیژن IMP خالص به جاي آنتیژن IMP متصل به Rodamin صورت گرفته و اثر همپوشانی بین گیرنده و دهنده برداشته شده و نمودارهاي نشري به سطوح پایینتر جابهجا میشوند. واکنش حاصل با دستگاه فلوریمتر بررسی و با نمودار اختصاصی نقاط کوانتومی - در این نمودار مقدار نور ساطع شده مشخص میباشد - مقایسه میگردد . - 4 -
.6 ارزیابی حساسیت و پایداري نانوبیوسنسور:
حساسیت و پایداري نانوبیوسنسورتولید شده به ترتیب با استفاده از روش Real Time PCR و روش FTIR انجام شد.
نتایج و بحث:
حسگر زیستی براي تشخیص آنتیژن IMP بر اساس سیستم FRET طراحی شد. به طوري که، مولکول دهنده نور نقاط کوانتومی هستند و گیرنده نور، مولکول رنگی یا ردامین است. سطح نقاط کوانتومی با آنتیبادي پلیکلونال پوشیده میشود. در حالت عادي زمانی که با دستگاه فلوریمتري محلول فوقالذکر تحریک شود، میزان جذب برابر با جذب نوري نقاط کوانتومی است. اما اگر مادهاي مانند ردامین که گیرنده نور است، در فاصله 10 آنگستروم از نقاط کوانتومی قرار گیرد، سیستم FRET برقرار می
