بخشی از مقاله
چکیده
این تحقیق طی سالهاي 1393-1392در دانشگاه آزاد شیراز بر روي 6 جمعیت سیب جمع آوري شده در نقاط مختلف استان کهگیلویه و بویراحمد انجام شد. پس از نمونهبرداري، استخراج DNA انجام گرفت و 13 آغارگر SCAR و SSR متصل به ژنهاي مقاوم به بیماري لکه سیاه سیب بر روي جمعیتهاي مورد بررسی تکثیر انجام گرفت. بعد از نمرهدهی باندها، نتایج تجزیه واریانس مولکولی نشان داد که 100 درصد تنوع مشاهده شده متعلق به درون جمعیتها بود.
همچنین نتایج فاصله ژنتیکی نشان داد که بیشترین فاصله بین دو جمعیت ka-mn و ka-h و کمترین فاصله بین دو جمعیت ka و si میباشد. همچنین نتایج تجزیه کلاستر نشان داد که خط برش با کمک تجزیه واریانس مولکولی، 6 جمعیت را به 2 گروه تقسیم میکند. از این نتایج بدست آمده امید است که با تلاقی جمعیتها دور از هم، همچنین تلاقی بین نمونهها موجود در هر جمعیت بتوان نتاجی با قدرت هتروزیس و مقاومت بالاتر به بیماري لکه سیب بدست آورد.
مقدمه
سیب به همراه اکثر میوههاي معتدله نظیر گلابی، آلو، هلو، زردآلو، هلو، گیلاس، توت فرنگی، تمشک و توت سیاه به خانواده گلسرخیان - - Rosaceae تعلق دارد. سیب، گلابی، به، زبان گنجشک کوهی و برخی جنسهاي غیر مشهور در زیر خانواده - pomoideae - تحت عنوان میوههاي دانه دار طبقه بندي می شوند. بر اساس یافتههاي محققین، جنس - - Malus تاکنون بیش از 30 گونه مختلف سیب شناسایی شده است که اغلب آنها قابلیت تلاقی با یکدیگر را دارند. سیب کشت شده احتمالا در نتیجه بومی شدن اولیه و در پی آن تلاقیهاي بین گونهاي حاصل شده است.. سیبها عموما خود ناسازگار بوده و برخی از طریق تامیزیدن تولید میشوند.
سیب بعنوان محصولات مهم باغی به شمار میآید .که زیر کشت فعلی کشور تقریبا حدود 148665 هکتار و صادارات کشور ما تقریبا 668192 تن میباشد. کشور ما از نظر سطح زیر کشت در مقام هفتم و از نظر صادرات در رده 29 جهان قرار دارد.درختان سیب در طولانی مدت با محركهاي محیطی و موتاسیون پاتوژنها مواجه شدهاند. براي از بین بردن پاتوژنها و تولید سیب با کیفیت بالا تلاشهاي زیادي انجام گرفته است. اکثر پاتوژنها با عوامل حفاظتی گیاه مبارزه میکنند. اصلاح مقاومت باعث از بین رفتن پاتوژنهاي گیاه توسط خود گیاه میشود. غالبترین و مضرترین پاتوژن در سیب مانند لکه سیاه سیب - Venttoria inaequalis - ، آتشک - Erwinia amylovoro - ، لکه برگی آلتر ناریایی - Alternaria galligeria - و غیره به اثبات رسیده است.
در تمام کشورهایی که سیب کشت می شود بیماري - Apple scab - وجود دارد، که از لحاظ اقتصادي مهمترین بیماري سیب به شمار می رود. این بیماري در مناطقی که بهار و تابستان خنک و مرطوب داررند شدیدا خسارت بار است و گاهی تا 70 در صد محصول را از بین می برد
بیشترین بیماري دنیا در شمال شرقی آمریکا، اروپا، استرالیا مشاهده گردیده است و در ایران در اکثر نقاط و از نظر کثرت به ترتیب در شمال ایران، آذربایجان، خراسان، فارس، همدان، اصفهان و اطراف تهران میباشد. بیماري لکه سیاه سیب به برگ، دمبرگ، شکوفه، کاسبرگ، میوه، دم میوه و گاهی به شاخه وفلس و جوانه نیز حمله می کند - اگریوس،جرج.ان . . - 1376 عامل بیماري لکه سیاه به فرم جنسی - Venturia-inaeqalis - و به فرم غیر جنسی Fusicladium- - - dendriticum می باشد.
یکی از راههاي کنترل این بیماري کشت ارقام نسبتا مقاوم مثل واریته زرد و قرمز لبنانی میباشد . - Soriano et al., 2009 - تا نیمه دوم قرن بیستم اکثر ارقام سیب دنیا، فقط ارقام بذري بودند که گزینش آنها به صورت تصادفی توسط باغداران انجام گرفته بود. در حالی که هم اکنون از 10000رقم به صورت رسمی ثبت شده است اما فقط تعدادکمی از انها حدود 40رقم, تجاري در سراسر دنیا کشت می شود.
از سال 1983بهترین ارقام شناخته شده سیب در دنیا در نهالهاي تصادفی یافت شده که منشا ان آمریکاي شمالی بود که در قرن 18و19معرفی شده بود. از جمله این ارقام میتوان گلدن دلیشز - 6/3 میلیون تن - ، رد دلیشز 3 - میلیون تن - و کوکوس اورنج پی پن 7/1 - میلیون تن - اشاره کرد. به نژادي کنترل شده سیب توسط - Thomas A. Kinght - شروع شد. او اولین بار ارقامی تولید کرد که داراي والدین مشخص بودند.
پس از آن تکنیک دورگه گیري کنترل شد، ادامه یافت بهطوري که این روش هم اکنون اساس برنامههاي اصلاح سیب را تشکیل می دهد و توجه به کارهاي اصلاحی انجام شده در گذشته موید ان است که عدم موفقیت در این امر بیشتر به دلیل ضعف در انتخاب والدین بوده است. در طول شصت سال اخیر با معرفی ژنهاي اصلی مقاوم که از سیبهاي وحشیMalus Floribunda 821 ایجاد میشود.
وجود ژنهاي مقاوم ترکیبی در گیاه توسط مجموعه نشانگرهاي پیوسته - MAS - تشخیص داده میشود. یکی از منابع مقاومت به Scab بهتر است از نقشه QTLاستفاده شود - . - Fletcher, H.R. 1969 هدف از این تحقیق گروه بندي جمعیتهاي مورد بررسی و تعیین بهترین تلاقی بین جمعیتها با کمک روش تجزیه کلاستر و فاصله ژنتیکی نی و نعیین میزان تنوع ژنتیکی بین و درون جمعیتها با کمک تجزیه واریانس مولکولی میباشد.
مواد و روشها
ابتدا از برگهاي جوان و تازه درختان سیب موجود در6 نقطه استان کهگیلویه و بویراحمد نمونهگیري شد. این برگها از باغات موجود در مناطق مختلف استان کهگیلویه و بویراحمد جمع آوري شد - جدول - 1 که با توجه به سطح زیر کشت هر منطقه و ارقام موجود در باغات آن منطقه، تعداد باغات مورد بازدید و همچنین تعداد نمونه ها متفاوت بود. بعد از جدا شدن برگها از درخت براي جلوگیري از تخریب DNA آنها، برگها در فویل آلومینیومی پیچیده شد و در یخ قرار داده شد و آنها را به فریزري با دماي حدود-80درجه سانتی گراد انتقال داده شد.
DNA با روش تغییر یافته CTAB، استخراج شد. سپس کمیت DNA توسط اشعه ماوراء بنفش در طول موج 260 نانو متر توسط دستگاه اسپکترو فتومتر ارزیابی و براي مشخص نمودن کیفیت DNA مورد نظر از ژل آگارز و دستگاه الکترو فورز استفاده شد. و با 13 نشانگرSCAR و SSR به وسیله PCR تکثیر انجام گردید. نمونه هاي تکثیري بر روي ژل برده شد و بر اساس حضور یا عدم حضور باند مربوطه نمره انجام گردید.
تجزیه کلاستر با استفاده از نرمافزار Mega4، فاصله ژنتیکی و تجزیه واریانس مولکولی با استفاده از نرمافزار GenAlex انجام گردید.
جدول -1جمعیتهاي مورد بررسی در این تحقیق
نتایج تجزیه واریانس مولکولی
جهت تسهیم گوناگونی ژنتیکی درون و میان گروهی جمعیتها توسط آزمون تجزیه واریانس مولکولی و برنامه جینآلکس نسخه 6,3 صورت گرفت. نتیجه تجزیه واریانس مولکولی نشان داد که سطح نسبتا بالایی از تمایز ژنتیکی را در درون جمعیتها - %100 - شاهد هستیم. همچنین جدول تجزیه واریانس مولکولی نشان داد که بین جمعیتها اختلاف معنیدار آماري وجود دارد
جدول -2تجزیه واریانس مولکولی بین جمعیتهاي سیب مورد بررسی
شکل -1میزان واریانس بین و درون جمعیتهاي سیب مورد مطالعه
فاصله ژنتیکی بین جمعیتهاي سیب
نتایج فاصله ژنتیکی بین جمعیتهاي سیب مورد بررسی بر اساس فاصله نی و با استفاده از نرمافزار جینآلکس نشان داد که دو جمعیت Ka-mn و Ka-h بیشترین فاصله - 0/172 - و دو جمعیت Ka و Si داراي کمترین فاصله ژنتیکی - 0/027 - بودند
جدول 3 -ماتریس فاصله ژنتیکی نی ما بین جمعیتهاي سیب مورد بررسی بر اساس آغازگرهاي تکثیري متصل به ژن بیماري لکه سیاه سیب
