بخشی از مقاله
مقدمه
آهن سه ظرفیتی که فرم غالب آهن در طبیعت است داراي حلالیت ناچیزي است 10-18) مولار در pH برابر (7/4 و
عملاً قابل جذب براي گیاهان و میکروارگانیسمها نمیباشد
.(22) همچنین میزان آهن در خاك در ارتباط با میزان فسفر و کلوئیدهاي خاك است. بنابراین غلظت آهن قابل دسترس براي موجودات زنده در خاکهاي کشاورزي (به علت مصرف بالاي کودهاي فسفره) معمولاً پایین است
.(16) غلظت پایین آهن در محلول خاك به همراه نیاز بالاي موجودات هوازي (گیاهان و میکروارگانیسمها) به آن و همچنین فراوانی ریزجانداران در ریزوسفر منجر به رقابت شدیدي براي آهن میشود .(12) تحت شرایط کمبود آهن، جذب آهن توسط ریزجانداران و گیاهان عموماً به عوامل کلات کننده براي حل و انتقال آهن غیرآلی (معدنی) وابسته است. بیشترین و متنوعترین
75
مجله پژوهشهاي سلولی و مولکولی (مجله زیست شناسی ایران) جلد 27، شماره 1، 1393
کلاتهاي بیوسنتزي، سیدروفورهاي میکروبی و به نسبت
کمتر فیتوسیدروفورهاي تولید شده به وسیله گرامینهها
میباشند .(11) سیدروفورها ترکیباتی با وزن مولکولی کم
(کمتر از 1000 دالتون) با میل ترکیبی بالا براي آهن سه
ظرفیتی میباشند که توسط باکتریها از جمله
سودوموناسهاي فلورسنت براي حل کردن آهن سه ظرفیتی در محیط خارج سلولی ترشح میشوند .(21) در تحقیقی که توسط وانسوت و همکاران انجام شد تأثیر
کمپلکس آهن- پایووردین بر مقدار آهن Arabidopsis
thaliana با کلات Fe-EDTA مقایسه گشت. آهن کلات
شده با پایووردین در مقایسه با Fe-EDTA به مقدار
بیشتري در گیاه Arabidopsis thaliana اندازهگیري شد و
به صورت معنیداري منجر به افزایش رشد و میزان کلروفیل در گیاه گردید. همچنین نتایج آنها نشان داد که در تمام شرایط آزمایش (ژنوتیپهاي مختلف گیاه و غلظتهاي متفاوت آهن) مقدار آهن به طور معنی دار در ریشه بیشتر از ساقه بود .(29) نتایج مطالعه تأثیر سیدروفور پایووردین بر روي رشد گیاهان شیرینک، ذرت و اسفناج نشان داد که سویه 7NSK2 از باکتري سودوموناس آریژینوزا که داراي توانایی تولید پایووردین میباشد نسبت به موتانت فاقد تولید پایووردین آن (MPMF1)، اثر سودمندي روي رشد گیاهان داشت. نتایج یک تحقیق دیگر نشان داد سویه
7NSK2 باعث کاهش معنیداري در جمعیت قارچهاي مستقر برروي ریشه و اندوریزوسفر (خاك زیر محل رشد ریشه) گردید، درحالی که موتانت MPMF1 تأثیري بر روي جمعیت قارچی نداشت. بررسی و ارزیابی نتایج به دست آمده این فرضیه را ثابت کرد که تولید فعال پایووردین در محیط رشد ریشه یک پیشنیاز براي تحریک رشد گیاه توسط سویه 7NSK2 بود .(26) در یک تحقیق بارنیس و همکاران مشاهده کردند که گیاه پنبه قادر به جذب آهن از سیدروفور دفريکسامین ب (DFOB) بوده و ذرت نیز به مقدار کمتر آهن را از این سیدروفور جذب کرد .(5) کلین و همکاران نیز نشان دادند که گیاه
آفتابگردان قادر به جذب مستقیم آهن پیوند شده به دفريکسامین ب از طریق ترشح ترکیباتی در ریزوسفر براي احیاء بیولوژیکی Fe(III)-DFOB به Fe(II)-DFOB
بود و توانست بر علایم کلروز غلبه کند، در حالی که سورگوم علایم کمبود آهن را نشان داد .(9) بنابراین با توجه به ارزیابی کلی نتایج مطالعات گذشته می توان گفت که باکتریهاي سودوموناس فلورسنت از طریق تولید سیدروفور نقش مهمی در افزایش تحرك و قابلیت جذب آهن در شرایط کمبود و همچنین رشد گیاه دارند. لذا این تحقیق با هدف شناسایی باکتریهاي برتر تولید کننده سیدروفور و بررسی تأثیر سیدروفور ترشح شده بر میزان جذب آهن در ذرت انجام شد.
مواد و روشها
جداسازي و شناسایی باکتریهاي سودوموناس فلورسنت:
تعداد 10 نمونه خاك ریزوسفري از گیاه ذرت در مناطق مختلف استان خراسان رضوي جمع آوري شد. نمونههاي خاك به آزمایشگاه منتقل و سریهاي رقت (پپتون 2 درصد سترون) تهیه و براي جداسازي و خالصسازي باکتریها از محیط افتراقی King B استفاده شد .(13) بررسیهاي میکروسکوپی، رنگ آمیزي گرم، آزمون تحرك در محیط نیمه جامد، آزمون آرژینین ديهیدرولاز، هیدرولیز اوره، اکسیداز و کاتالاز بر روي جدایههایی که کلنیهاي آنها داراي خاصیت پرتوافشانی بودند انجام شد .(6) سویههاي (Pf) Pseudomonas fluorescens از گروه دامپزشکی و (PA) Pseudomonas aeruginosa از گروه گیاهپزشکی دانشگاه فردوسی مشهد به عنوان مرجع انتخاب شدند.
جدایهها در سولفات منیزیم سترون 0/1 مولار در دماي 4
درجه سانتیگراد براي استفاده هاي بعدي نگهداري شدند.
بررسی تولید سیدروفور در جدایههاي به دست آمده:
الف - اندازه گیري تولید سیدروفور با استفاده از -CAS
آگار: براي ارزیابی تولید سیدروفور از تلقیح جمعیت تنظیم
76
مجله پژوهشهاي سلولی و مولکولی (مجله زیست شناسی ایران) جلد 27، شماره 1، 1393
شده باکتریها در محیط -CAS آگار استفاده گردید. تهیه این محیط بر اساس روش اصلاح شده الکساندر و زوبرر میباشد .(4) براي تهیه این محیط چهار محلول (محلول معرف Fe-CAS، محلول بافر، محلول غذایی و محلول کازوآمینواسید) به طور مجزا تهیه، استریل و سپس باهم مخلوط شدند. پس از جامد شدن محیط کشت، مقدار 100
میکرولیتر از کشت مایع باکتریها در محیط کشت KingB
به صورت نقطهاي در مرکز پلیتها تلقیح شد. پلیتهاي تلقیح شده در دماي 28 درجه سانتیگراد نگهداري شدند. توانایی تولید سیدروفور باکتریها از روي تغییر رنگ بسیار واضح محیط -CAS آگار از آبی به نارنجی مشخص شد. قطر کلنی باکتریها و هاله نارنجی رنگ تشکیل شده در اطراف کلنی در فواصل زمانی 24، 48، 72 و 96 ساعت اندازه گیري گردید. همچنین نسبت قطر هاله به قطر کلنی باکتریها تعیین گشت.
ب - اندازهگیري تولید سیدروفور با استفاده از اسپکتروفتومتري: براي اندازهگیري میزان تولید سیدروفور باکتریهایی که در آزمایش -CAS آگار توانایی تولید سیدروفور را نشان دادند از روش اسپکتروفتومتري (مدل دستگاه (instruments T70 PG + استفاده شد .(8) به این صورت که مقدار 100 میکرولیتر از کشت 24 ساعته باکتریها در محیط مایع سوکسینات به ارلنهاي 100
میلیلیتري حاوي 40 میلیلیتر محیط تازه سوکسینات منتقل شد. محیط سوکسینات شامل 3 گرم KH2PO4، 6 گرم
K2HPO4، 0/2 گرم MgSO4. 7H2O، 1 گرم (NH4)2SO4
و 4 گرم سوکسینیک اسید در هر لیتر و pH آن روي 7
تنظیم گردید. این محیطها به مدت 40 ساعت در دماي 28
درجه سانتیگراد و 120 rpm بر روي شیکر نگهداري شدند. سلولهاي باکتري با سانتریفیوژ (مدل دستگاه -13
(Sigma; C در 10000 rpm به مدت 10 دقیقه رسوب داده شدند. پس از حذف رسوب باکتري میزان جذب مایع رویی در طول موج 400 نانومتر با دستگاه اسپکتروفتومتر
قرائت شد. دادههاي حاصله با استفاده از فرمول
A BC به مول در لیتر تبدیل شدند.
= A میزان جذب = ε ضریب جذب مولی
= B قطر کوت =C غلظت ماده
ج - آزمون گلخانهاي براي بررسی اثر سیدروفور در جذب آهن در گیاه ذرت:
استخراج سیدروفور باکتریها: به منظور استخراج سیدروفور باکتریها جهت بررسی تأثیر سیدروفور بر میزان جذب آهن در گیاه ذرت از روش میر و عبداله استفاده گردید .(20)
به این منظور 7 جدایه باکتري سودوموناس بر اساس نسبت قطر هاله به کلنی در آزمایش -CAS آگار در سه محدوده زیاد، متوسط و کم انتخاب شدند. ابتدا باکتریها به مدت 72
ساعت در 40 میلی لیتر محیط کشت سوکسینات در ارلنهاي 100 میلی لیتري بر روي انکوباتور شیکردار در دماي 28 درجه سانتیگراد رشد داده شدند. سپس سلولهاي باکتري با استفاده از سانتریفیوژ (با دور 10000 rpm به مدت 20 دقیقه) از محیط کشت جدا شدند. براي اطمینان بیشتر از عدم وجود باکتري در محلول رویی، این محلول از فیلتر 0/22 میکرومتر عبور داده شد و محلول بدون باکتري حاوي سیدروفور براي انجام آزمایش در دماي 4
درجه سانتیگراد در یخچال نگهداري گردید.
تهیه کمپلکس سیدروفور- آهن :ΙΙΙ به منظور تهیه کمپلکس سیدروفور-آهن ΙΙΙ مقدار 10 میلیلیتر محلول
FeCl3 با 30 میلیلیتر محیط کشت حاوي سیدروفور استخراج شده از 7 جدایه منتخب (نسبت سیدروفور به آهن (3:1 مخلوط شد. pH محلولها با استفاده از بافر MES
(فرمول شیمیایی S4NO13H6C، جرم مولی 195/2 10 (g/molمیلی مولار بر روي 6/5 تنظیم شد. این
محلولها به مدت 12 ساعت براي تشکیل کمپلکس سیدروفور-آهن ΙΙΙ بر روي شیکر با دور 120 rpm و
دماي اتاق قرار داده شدند .(5)
77
Hexadecyltrimethyl-)
مجله پژوهشهاي سلولی و مولکولی (مجله زیست شناسی ایران) جلد 27، شماره 1، 1393
آزمایش به صورت طرح کاملاً تصادفی شامل 11 تیمار و سه تکرار انجام شد. تیمارهاي آزمایش شامل 7 کمپلکس سیدروفور-آهن ΙΙΙ تهیه شده از جدایههاي P16، P33، P34، P42، P47، Pf و PA و همچنین محلول FeCl3،
محلول Fe-EDTA، محیط کشت سوکسینات بدون باکتري
(Suc) و شاهد که محلول غذایی هوگلند بدون آهن
(Control) بود. pH محلول غذایی با استفاده از کربنات کلسیم 0/1) گرم در لیتر) در 7/2 تا 7/4 تنظیم شد .(10)
غلظت نهایی آهن در تیمارهاي آزمایش 5 ppm بود. به منظور انجام آزمون گلخانهاي از بذرهاي ذرت رقم 704
سینگل کراس استفاده شد. محلولهاي غذایی و تیمارهاي آزمایش هر هفته به مدت 4 هفته به صورت تازه تهیه و تعویض گردید.
پس از گذشت 1 ماه از دوره رویشی و پدیدار شدن علائم کمبود آهن، غلظت کلروفیل با استفاده از دستگاه کلروفیلمتر (Spad) اندازهگیري شد. به این منظور در هر گیاه برگ دوم از بالا انتخاب شد و در سه نقطه از برگ میزان کلروفیل قرائت و سپس میانگین سه قرائت به عنوان محتواي نسبی کلروفیل در گیاه مورد نظر ثبت گردید.
سپس نمونهها در آون در دماي 70 درجه سانتیگراد به مدت 3 روز قرار داده شد و وزن خشک ریشه و اندام هوایی اندازهگیري گردید. پس از آن اندام هوایی با روش هضم تر عصارهگیري شد و غلظت آهن در عصاره با استفاده از دستگاه جذب اتمی (مدل (Shimadzu AA-670
اندازهگیري شد. تجزیه واریانس و مقایسه میانگین دادهها با استفاده از نرمافزار MSTAT-C و با استفاده از آزمون دانکن در سطح 1 درصد انجام شد.
نتایج و بحث
ارزیابی تولید سیدروفور در محیط کشت -CAS آگار:
از مجموع 70 باکتري جداسازي شده از ریزوسفر ذرت با کاربرد آزمونهاي بیوشیمیایی، 38 باکتري به عنوان جنس
سودوموناس شناسایی شدند. تمام 38 جدایه بومی و سویه
هاي Pf و PA قادر به رشد در محیط -CAS آگار و تولید سیدروفور بودند. رنگ هاله تشکیل شده از نارنجی پررنگ تا زرد متغیر بود. هاله نارنجی رنگ تشکیل شده در اطراف جدایه P16 که نمایانگر تولید سیدروفور میباشد در شکل
-1 الف نشان داده شده است. این تمایز در تغییر رنگ میتواند در ارتباط با تفاوتهاي ساختمانی در انواع سیدروفورهاي ترشح شده باشد. دو گروه بزرگ از سیدروفورها شامل هیدروکسامات و کتکولیت در pH
طبیعی pH) محیط -CAS آگار)، با آهن سه ظرفیتی تشکیل کمپلکس داده که این امر با تغییر رنگ محیط
-CAS آگار قابل مشاهده میباشد .(23) بنابراین تغییر رنگهاي متفاوت در محیط -CASآگار به تولید سیدروفورهاي مختلف توسط میکروارگانیسمها اشاره دارد و شدت رنگ معمولاً با غلظت سیدروفور مرتبط می باشد
(شکل -1 ب). در مورد جدایهها، نسبت قطر هاله به کلنی در روز اول از 0/01 تا 3/67، در روز دوم از 0/55 تا
4/28، در روز سوم از 1/6 تا 4/25، در روزچهارم از 1/2 تا
4/3 و به طور متوسط از 0/7175 تا 4 متغیر بود. بیشترین متوسط نسبت قطر هاله به کلنی 4 بود که مربوط به جدایه
P16 بود. پس از آن جدایه Pf با متوسط نسبت قطر هاله به کلنی 3/9875 بیشترین تولید سیدروفور را نشان داد. 45
درصد از جدایه ها نسبت قطر هاله به کلنی بیشتر از حد متوسط (2/74) داشتند. مشخصه عمومی سودوموناسهاي فلورسنت تولید پیگمانهایی است که در برابر نور فرابنفش با طول موج کوتاه 254) نانومتر) به ویژه در شرایط کمبود آهن خاصیت پرتوافشانی دارند. این پیگمانهاي فلورسنس و محلول در آب از جمله انواع مهم سیدروفورها هستند
.(15) ارزیابی توان تولید سیدروفور باکتریهاي سودوموناس
عموماً در محیط کشت -CAS آگار انجام میشود که توسط اسکوین و نیلندز ارائه شده است .(25) رقابتی که در محیط CAS براي پیوند با آهن بین کمپلکس فریک معرف رنگی به نام کروم آزورل (CAS) S، دترجنت هگزا
دسیل تري متیل آمونیوم بروماید
78
(ammonium bromide (HDTMA)
مجله پژوهشهاي سلولی و مولکولی (مجله زیست شناسی ایران) جلد 27، شماره 1، 1393
و یک کلاتکننده یا
سیدروفور میکروبی بوجود میآید اساس ارزیابی تولید سیدروفور در این محیط میباشد. به نظر میرسد تغییر رنگ معرف CAS از آبی به نارنجی در اثر برداشتن آهن از این معرف توسط سیدروفور ایجاد میشود. نتایج حاصل از ارزیابی توان تولید سیدروفور توسط عباس زاده دهجی نشان داد که تمام سویههاي سودوموناس توانستند بر روي محیط کشت -CAS آگار هالههاي نارنجی رنگ که دلیلی بر تولید سیدروفور است، ایجاد کنند. متوسط نسبت قطر هاله به کلنی در سویهها بین 0/37 تا 2/73 متغیر بود .(3)
آزمایشات رسولی صدقیانی و همکاران نیز نشان داد که
201 سویه از سودوموناسهاي فلورسنت جدا شده از ریزوسفر گندم همگی توان تولید سیدروفور داشتند و نسبت قطر هاله به کلنی در این سویهها بین 2/21 تا 3/96
متغیر بود .(1)
ارزیابی کمی تولید سیدروفور با استفاده از روش
اسپکتروفتومتري: در اندازهگیري توان تولید سیدروفور باکتریهاي سودوموناس بصورت کمی که بصورت اختصاصی مقدار سیدروفور نوع پایووردین قابل ارزیابی است مشخص شد که تمام 38 جدایه بومی و سویههاي Pf
و PA قادر به تولید سیدروفور در مقادیر مختلف بودند.
تولید پیگمانت فلورسنت در محیط کشت سوکسینات به
وسیله رنگ زرد- سبز و فلورسنت قوي آن مشخص میشود که به عنوان یک نشانگر مشخص براي شناسایی باکتریهاي سودوموناس استفاده میشود. از این محیط کشت براي جداسازي و خالص سازي پیگمانت فلورسنت استفاده میشود .(20) در این آزمایش میزان تولید سیدروفور جدایهها از 0/96 تا 132/5 میکرومول در لیتر متغیر بود. نتایج حاصل از این آزمون نشان داد که جدایه
P33 با تولید سیدروفور به میزان 132/5 میکرومول در لیتر بیشترین میزان تولید سیدروفور را به خود اختصاص داد. پس از آن جدایه P35 با مقدار 128 میکرومول در لیتر و P34 با مقدار 123/5 میکرومول در لیتر در مرتبه بعدي از نظر تولید سیدروفور قرار داشتند. 72/5 درصد جدایهها میزان تولید سیدروفور را کمتر از حد متوسط
29/86) میکرومول در لیتر) نشان دادند. نتایج پژوهش زایااو و کیسالیتا که بر روي باکتري سودوموناس آریژینوزا
انجام شد نشان داد که حداکثر جذب در 400 نانومتر نشانگر وجود سیدروفورها در محلول رویی است .(30)
کاستاندا و همکاران نیز نتایج مشابهی را ارائه دادند .(8)
محیط کشت سوکسینات تلقیح شده با باکتریهاي
سودوموناس و محیط کشت بدون باکتري در شکل
2 نشان داده شده است.
باکتري PA
باکتري Pf
الف ب
شکل -1الف- هاله سیدروفوري باکتري P16 در محیط آبی -CAS آگار
شکل -1ب- تمایز در تغییر رنگ محیط کشت -CAS آگار توسط باکتري Pf و PA
79
مجله پژوهشهاي سلولی و مولکولی (مجله زیست شناسی ایران) جلد 27، شماره 1، 1393
شکل -2 محیط کشت سوکسینات تلقیح شده با باکتریهاي سودوموناس در مقایسه با شاهد
جدول -1 نتایج تجزیه واریانس تیمارهاي آزمایش
میانگین مربعات
منابع تغییر درجه آزادي میزان کلروفیل وزن خشک ریشه وزن خشک اندام هوایی میزان آهن
(بدون واحد) (گرم) (گرم) (پی پی ام)
تیمار 10 ٭٭224/620 ٭٭1/632 ٭٭7/158 ٭٭11634/297
خطا 22 10/233 0/018 0/351 130/909
٭٭- معنیدار بودن در سطح 1 درصد
آگار-CAS روش در پس کلنی به هاله قطر نسبت
روز 4 از
غلظت سیدروفور در روش اسپکتروفتومتري (میکرومول در لیتر)
شکل -3 همبستگی بین غلظت سیدروفور اندازهگیري شده در روش اسپکتروفتومتري و نسبت قطر هاله به کلنی در روش -CAS آگار
مقایسه نتایج حاصل از روشهاي -CAS آگار و
اسپکتروفتومتري: نتایج مقایسه دو روش -CAS آگار و اسپکتروفتومتري نشان داد که جدایه P16 که در روش
-CAS آگار بیشترین تولید سیدروفور را دارا بود در این روش جزء باکتریهاي برتر قرار نگرفت. همچنین باکتري Pf نیز که در روش -CAS آگار پس از P16 بیشترین میزان
تولید سیدروفور را نشان میداد در این روش در مرتبه نهم قرار گرفت. جدایههاي دیگري نیز غیر منطبق بودن روش
-CAS آگار را با روش اسپکتروفتومتري نشان دادند. همان طور که قبلاً ذکر شد روش اسپکتروفتومتري به صورت اختصاصی فقط قادر به تعیین کمی سیدروفور نوع پایووردین است، زیرا سیدروفورهاي مختلف در طول
80
FeCl3
مجله پژوهشهاي سلولی و مولکولی (مجله زیست شناسی ایران) جلد 27، شماره 1، 1393
موجهاي متفاوت قابل تشخیص میباشند. لذا به نظر میرسد جدایههایی که در محیط CAS میزان بالایی از تولید سیدروفور را نشان دادند علاوه بر سیدروفور نوع پایووردین قادر به تولید سیدروفورهاي دیگري هستند که عامل تغییر رنگ معرف CAS از آبی به نارنجی میباشند.
بنابراین بنظر می رسد که از روي این اختلافات میتوان به تولید و مقدار تولید سیدروفورهاي غیر از پایووردین در جدایههاي سودوموناس فلورسنت پی برد. در نتایج حاصل از پژوهش شریفی و همکاران نیز نشان داده شد که سویه
UTPF76 که در روش -CAS آگار بیشترین میزان تولید سیدروفور را دارا بود، در روش اسپکتروفتومتري باکتري برتر از نظر تولید سیدروفور نبود .(2) شکل 3 نشان دهنده ضریب همبستگی بسیار کم بین غلظت سیدروفور اندازهگیري شده در روش اسپکتروفتومتري و نسبت قطر هاله به کلنی پس از 4 روز در روش -CAS آگار میباشد.
نتایج آزمون گلخانه اي: نتایج تجزیه واریانس تیمارهاي آزمایش در جدول 1 نشان داده شده است. کلیه پارامترهاي اندازهگیري شده نظیر میزان کلروفیل و وزن خشک ریشه و اندام هوایی و همچنین میزان آهن گیاه از نظر آماري در سطح 1 درصد معنی دار بود.
تأثیر کلاتهاي مختلف سیدروفور- آهن بر وزن خشک
ریشه در گیاه ذرت: بیشترین میزان وزن خشک ریشه ذرت در گیاهان تحت تیمار کلات سیدروفور- آهن سویه Pf مشاهده شد که از نظر آماري با سایر تیمارها به روش دانکن در سطح 1 درصد اختلاف معنیدار نشان داد. پس از آن گیاه تحت تیمار کلات Fe-EDTA و P16 داراي بیشترین میزان وزن خشک ریشه بودند و با گیاه شاهد اختلاف معنیدار در سطح 1 درصد نشان دادند اما با گیاه
تحت تیمار اختلاف معنیدار نداشتند. به نظر
میرسد تیمار FeCl3 با تأمین بخشی از آهن مورد نیاز گیاه که احتمالاً با کمک فیتوسیدروفور به گیاه منتقل شده است توانسته میزان وزن خشک ریشه را در حد قابل قبولی
افزایش دهد. پس از آن گیاهان تحت تیمار سویه P42 و
شاهد نسبت به تیمار FeCl3 داراي میزان کمتري از وزن خشک ریشه بودند اگرچه این اختلاف از نظر آماري معنیدار نبود. تیمارهاي PA، P33، P34، P47 و تیمار محیط کشت سوکسینات اختلاف معنیداري با هم نشان ندادند. نتایج این بخش نشان داد که وزن خشک ریشه در گیاهان تحت تیمار کلات سیدروفور- آهن سویههاي با توان متوسط یا کم در تولید سیدروفور به استثناي تیمار
P42 در مقایسه با شاهد کمتر بود و تنها کلات سیدروفور-
