بخشی از مقاله
چکیده
سابقه و هدف: فسفر یکی از عناصر ضروری برای رشد گیاه است. استفاده از باکتری های حل کننده فسفات به عنوان کود زیستی موجب افزایش جذب فسفات توسط گیاهان می شود، لذا هدف از این پژوهش جداسازی باکتری های حل کننده فسفات از خاک های ریزوسفری و بررسی عملکرد آنها تحت استرس های دما، pH و شوری و همچنین بررسی فعالیت های تحریک کنندگی رشد و افزایش جذب فسفات گیاه کلزا - Brassica napus L. - توسط آنها، به منظور انتخاب جدایه مناسب جهت تولید کود بیولوژیک می باشد. مواد و روش ها: برای این منظور از ریزوسفر Peganum harmala ، Althaaea officinalis ، Alhaji maurorum ، که در مناطق غنی از فسفات کرمان قرار داشتند نمونه برداری انجام شد و در نهایت تعداد 109 جدایه جداسازی شد. توانایی انحلال تری کلسیم فسفات به صورت کیفی و کمی در محیط - Pikovskaya's - pvk بررسی گردید که پنج جدایه به عنوان جدایه های برتر انتخاب گردیدند.
همچنین انحلال فسفات تحت استرسهای دماهای 37-30 -25، 9-7-5 pH و شرایط شوری بررسی گردید. نتایج: نتایج نشان دادند که جدایه A2 تواناترین جدایه در انحلال فسفات می باشد و به ترتیب دمای30 œc ، 9 =pH، شوری Nacl %2 و مدت زمان 11 روز گرمخانه گذاری به عنوان شرایط مناسب برای انحلال تری کلسیم فسفات توسط جدایه A2 میباشد. در بررسی فعالیت تحریک کنندگی رشد گیاه توسط پنج جدایه، تمامی آنها توانایی تولید ایندول استیک اسید، سیانید هیدروژن، کاتالاز، آمونیوم و Acc د آمیناز را داشتند. در بررسی عملکرد جدایه ها در جذب فسفات توسط گیاه کلزا ،جدایه A2 در غلظت 10 و جدایه A72 در غلظت 20 mg/kg بیشترین میزان فسفات در گیاه نسبت به نمونه شاهد را نشان دادند . نتیجه گیری: بنابراین جدایه A2 به عنوان مناسب ترین کاندید از نظر انحلال فسفات و تحریک کنندگی رشد گیاه می باشد و جهت تولید کود زیستی پیشنهاد می گردد.
واژگان کلیدی: باکتریهای حل کننده فسفات، کود زیستی، کلزا، فعالیتهای تحریک کنندگی رشد گیاه، ریزوسفر
-1 مقدمه و هدف
طی چند دهه اخیر به علت افزایش جمعیت و تقاضای روزافزون برای موادغذایی ، مصرف کود های شیمیایی به منظور افزایش میزان تولید در واحد سطح به شدت افزایش یافته است .[1] مصرف بی رویه کودهای شیمیایی موجب عدم تعادل عناصر و مواد غذایی موجود در خاک، کاهش بازده محصولات کشاورزی و به خطر افتادن سلامت انسانها و دیگر موجودات زنده خواهد شد. نیاز به جایگزینی مناسب برای کودهای شیمیایی زمانی احساس می شود که بدانیم علاوه بر آسیب های زیست محیطی ناشی از کاربرد کودهای شیمیایی ، محدود بودن منابع، افزایش قیمت تمام شده و تثبیت شدن قسمت اعظمی از کودهای فسفاته مصرفی به شکل غیرقابل استفاده برای گیاه نیز پیامد استفاده از این کودها هستند .[2] به همین علت امروزه استفاده از کودهای بیولوژیک مورد توجه قرار گرفته است که مکانیسم عمل آنها قابلیت جذب عناصر غذایی گیاه در خاک را افزایش می دهد .[2] فسفر یکی از عناصر ضروری برای رشد گیاه است و در خاکها به دو شکل آلی و معدنی وجود دارد.
عناصری مانند Ca2+، Fe3+ و Al3+ فسفات را جذب کرده و باعث تشکیل ترکیبات نامحلول میگردد .[3] قسمت اعظم میکرو ارگانیسمهای محلول کننده فسفات در ریزوسفر گیاهان متمرکز شدهاند. میکروبهای خاک توانایی تبدیل اشکال نامحلول فسفر به اشکال محلول را دارند .[4] طی فرآیند انحلال بخشی از فسفر محلول، توسط باکتری حل کننده فسفات استفاده میشود اما از آنجائیکه مقدار فسفر حل شده بیش از نیاز باکتریها است، لذا این مقدار آزاد می تواند در اختیار گیاه قرار گیرد PGPR .[5] یا باکتری های تحریک کننده رشد گیاه ، گروهی از باکتری های ریزوسفر هستند که به طور مستقیم - انحلال فسفات ، تولید هورمونها... - و غیر مستقیم - تولید کاتالاز ، سیانید هیدروژن و.... - موجب افزایش رشد گیاه می شوند. با توجه به اثرات مثبت برخی ازاین باکتریهای از قبیل تولید سیدروفور، تولید هورمونها و ویژگی بیوکنترلی آنها بر ضد قارچها ی بیماریزا، به نظر تمرکز نمودن بر تحقیقاتی که منجر به حصول چنین میکروارگانیسم هایی باشد، بسیار مثمر ثمر خواهد بود.
زیرا کود های زیستی تلقیحات میکروبی هستند که علاوه بر افزایش جذب عناصر غذایی، موجب افزایش رشد گیاه می شوند، بنابراین با کاربرد سویه های PGPR می توان چندین هدف را به طور همزمان دنبال کرد .[6]باتوجه به اینکه در خاک های آهکی ایران که در اقلیم های خشک و نیمه خشک تحول پیدا کرده اند، وجود pH بالا، درصد زیاد کربنات کلسیم، کمی مواد آلی و خشکی خاک باعث شده اند که جذب فسفر کمتر از مقدار لازم برای تامین رشد بهینه اکثر محصولات کشاورزی باشد. لذا هدف از این پژوهش جداسازی باکتری های حل کننده فسفات از خاک های ریزوسفری و بررسی عملکرد آنها تحت استرسهای دما، pH و شوری و همچنین بررسی فعالیت های تحریک کنندگی رشد گیاه توسط آنها، به منظور انتخاب سویه مناسب جهت تولید کود بیولوژیک می باشد.
-2 مواد و روشها الف- نمونه برداری و غربالگری باکتریهای ریشه
قطعاتی از ریشه و مقداری از نمونه خاک از عمق 30 سانتی متری ریزوسفر گیاهان نام برده جمع آوری و نمونههای گرفته شده در ظروف استریل به آزمایشگاه منتقل گردید. جهت جداسازی باکتری های حل کننده ی فسفات از نمونه تهیه شده از خاک ریزوسفر گیاهان Peganum harmala، Althaaea officinalis و Alhaji maurorum ، یک گرم از نمونه خاک را تحت شرایط استریل به لوله حاوی 9 میلی لیتر سرم فیزیولوژی اضافه کرده، سپس رقتهای متوالی از نمونه تهیه شد و از رقت ها 0/5میلی لیتردر سطح محیط TSA آگار تلقیح و با استفاده از پخش کننده شیشه ای کشت سطحی انجام شد و به مدت 24 تا 48 ساعت در انکوباتور در دمای 28 درجه سانتی گراد قرار داده شد.[6]
ب- بررسی توانایی انحلال ترکیبات مختلف نامحلول فسفات
به منظور بررسی توانایی انحلال فسفات توسط باکتری های جداشده، از هر باکتری در سطح محیط - 3LNRYVND\DʼV $JDU - کشت داده شد و در محیط کشت ترکیبات ca3 - po4 - 2 به عنوان منبع فسفات استفاده شد. گرمخانه گذاری به مدت 48 تا 72 ساعت صورت گرفت و در ادامه باتوجه به ایجاد هاله در اطراف کلنی باکتری، توانایی انحلال فسفات مورد بررسی قرار گرفت. با توجه به تشکیل هاله در اطراف کلنی شاخص انحلال فسفات بر طبق فرمول زیر محاسبه گردید.[14]
پ- بررسی اثر فاکتورهای محیطی روی رشد سویه های برتر
بررسی اثر دما بر رشد باکتری ها : 5 سویه برتر در انحلال فسفات به لوله های حاوی محیط کشت TSB تلقیح شد و در دماهای 42 - 37 و 55 درجه سانتی گراد به مدت 48 ساعت گرمخانه گذاری گردید
بررسی اثر شوری بر رشد باکتری ها : 5 سویه برتر در انحلال فسفات به لوله های حاوی محیط کشت TSB که حاوی %6 - %4 - %2 و %8 کلرید سدیم بودند تلقیح شد و در دمای 30 درجه سانتی گراد به مدت 48 ساعت گرمخانه گذاری گردید.بررسی اثر pH بر رشد باکتری ها : 5 سویه برتر در انحلال فسفات به لوله های حاوی محیط کشت TSB که pH آنها را به 7 -5- 3 و 9 رسانده شده بود ، تلقیح شد و در دمای 30 درجه سانتی گراد به مدت 48 ساعت گرمخانه گذاری گردید.
ت- انتخاب سویه های برتر و بررسی کمی توانایی انحلال
از کشت جوان تازه هر یک از جدایه های برتر محلولی معادل ./5 - 1/5×108 cell/ml مک فارلند - تهیه شد و 1 میلی لیتر از هر محلول را به یک فلاسک حاوی 300 میلی لیتر محیط کشت pvk مایع اضافه کرده و به مدت15روز در دمای 28 درجه سانتی گراد در انکوباتور شیکردار با دور200 rpm گرمخانه گذاری شد. در روزهای11 ,7 ,3و 15 نمونه برداری انجام شد. نمونه ها در ظرف های درب دار و در دمای -20 نگهداری شد، پس از پایان مدت15روز، جذب قرائت گردید. pH [6] محیط مایع در روزهای15،11،7،3 با استفاده از pH متر اندازه گیری شد.. [15]
ج- بررسی تاثیر دما بر روی انحلال فسفات
از کشت جوان هر یک از جدایه های برتر محلولی معادل ./5 - 1/5×10 8 cell/ml مک فارلند - تهیه شد و 1 میلی لیتر از هر محلول را به یک فلاسک حاوی 300 میلی لیتر محیط کشت pvk مایع اضافه کرده و به مدت 11 روز در دماهای37-30-25درجه سانتی گراد در انکوباتور شیکردار با دور200 rpm گرمخانه گذاری شد و پس از پایان مدت 11 روز جذب قرائت گردید. [16,11]
ح- بررسی تاثیر شوری بر روی انحلال فسفات
از کشت تازه هر یک از جدایه های برتر محلولی معادل ./5 - 1/5×108 cell/ml مک فارلند - تهیه شد و 1 میلی لیتر از هر محلول را به یک فلاسک حاوی 300 میلی لیتر محیط کشت pvk مایع که درصد های متفاوت از% 6 - %4 - %2 - Nacl و - % 8 را دارند، تلقیح کرده و به مدت 11 روز در دمای30 درجه سانتی گراد در انکوباتور شیکردار با دور200 rpm گرمخانه گذاری شد.[16,11]
خ- بررسی تاثیر pH بر روی درصد انحلال فسفات
از کشت جوان هر یک از جدایه های برتر محلولی معادل ./5 - 1/5×108 cell/ml مک فارلند - تهیه شد و 1 میلی لیتر از هر محلول را به یک فلاسک حاوی 300 میلی لیتر محیط کشت pvk مایع در 9 - 7 -5pH ، تلقیح کرده و به مدت 11 روز در دمای30 درجه سانتی گراد در انکوباتور شیکردار با دور200 rpm گرمخانه گذاری گردید. پس از پایان مدت 11 روز جذب قرائت گردید برای هر یک از آزمایشات یک فلاسک نیز به عنوان کنترل در نظر گرفته شد[16,11]
