بخشی از مقاله
جداسازی و شناسایی باکتریهای اسید لاکتیک ترخینه، میان وعدهای تخمیری، با روشهای مبتنی بر کشت و مولکولی
چکیده
هدف: ترخینه غذایی تخمیری و سنتی میباشد که در استانهای غربی ایران به عنوان میان وعده مصرف میگردد. هدف این پژوهش جداسازی و شناسایی فلور لاکتیکی این میان وعده غذایی، با استفاده از آزمونهای مبتنی بر کشت و همچنین روش-های مولکولی میباشد.
روش پژوهش: 9 نمونه ترخینه از استان کرمانشاه تهیه شد. بعد از ایزوله کردن، ابتدا آزمون گرم و کاتالاز انجام پذیرفت. سپس تستهای بیوشیمایی و تخمیر قند و در نهایت توالی یابی 16 SRNA جهت شناسایی دقیق ایزوله به کار رفت.
نتایج و بحث: بر اساس آزمونهای بیوشیمیایی وجود 4 جنس لاکتوباسیلوس، پدیوکوکوس، انتروکوکوس و لویکونوستوک در ترخینه تایید شد. با انجام آزمون تخمیر کربوهیدرات ، گروهبندی جدایهها انجام پذیرفت. در نهایت با انجام PCR وجود 10 کونه مختلف در ترخینه تایید گشت که جمعیت غالب متعلق به جنس لاکتوباسیلوس پلانتاروم بود.
نتیجه گیری کلی: با توجه به غالب بودن جنس لاکتوباسیلوس در ترخینه و همچنین پتانسیل بالای پروبیوتیکی این جنس میتوان انتظار داشت مصرف این میان وعده تخمیری باعث افزایش سلامتی در فرد مصرف کننده میشود.
مقدمه
در تاریخ ایران در حدود هزار سال پیش برای اولین بار ترخینه در لغت نامه زمخشری نام برده میشـود و پـس از آن در اواخر قرن دهم هجری شمسی در فرهنگ جهانگیری با نام ترخینه شناسایی میشود و سپس در فرهنـگ رشـیدی 1033) هجری شمسی) و آنندراج 1267) ه.ش) نیز ذکر میگردد. تر در فارسی به معنای خیس یا مرطـوب و خـوان بـه معنـای غـذا، کاسه چوبی بزرگ و جای نهار خوردن است. بنابراین ترخینه در فارسی به معنای غذای آبکی است. در ایـران غالبـا در اسـتان-
های ایلام، کردستان، لرستان، آذربایجان غربی و اراک به صورت سنتی تهیه میشود. نحوهی تهیه ترخینه اینگونه میباشد کـه دوغ آن را در بهار تهیه میکنند، دوغ را در مشک میریزند تا آب آن گرفته شود. سپس گندم را تمیز کرده پس از شست وشـو و پختن آنرا خشک کرده و آسیاب میکنند و به صورت بلغور گندم در میآورند. بعد آن را با دوغی که از قبل آمـاده شـده و بـا آب رقیق گشته به همراه شلغم رنده شده و مقداری خمیر ترش مخلوط می کنند. و در نهایت به مدت حداقل 3 روز و حـداکثر 6 روز در طول میکشد تا بافت آن نرم گردد. تخمیر در دمای اتاق انجام میگیرد. ترخینهی تولید شده را به صورت دایرههـای گرد و نازک درآورده، آن را در برابر آفتاب و روی گیاه پونه خشک میکنند. قبلا به جای دیگ، گودالی داخل زمین میکندنـد، آن را با گل تمیز اندود کرده و به وسیلهی آرد آن را خشک نموده و صیقل میدادند و مخلـوط دوغ و بلغـور را در آن ریختـه و روی آن را با طلق میپوشاندند. بعد از 3 تا 6 روز آن را درآورده، خشک میکردند.[5] توجه به مواد غـذایی مفیـد و سـلامتیزا برای تامین نیازهای غذایی بشر از دیرباز مورد توجه بوده است که در این بین غذاهای تخمیری جایگـاه ویـژهای دارنـد. جهـت انجام تکنولوژی تخمیر وجود باکتریهای اسید لاکتیک ضروری میباشد. از آنجا که باکتریهای اسید لاکتیـک جزئـی از فلـور طبیعی شیر خام میباشند شیر و فراورههای لبنی وابسته از دیربار به عنوان بخشی از رژیم غذایی بوده اسـت. مطـابق تعریفـی که فدراسیون بین المللی محصولات لبنی 1(IDF) و سـازمان جهـانی اسـتاندارد 2(ISO) در سـال 2008 ارائـه نمـوده اسـت، باکتریهای اسید لاکتیک، باکتریهایی گرم مثبت، بی حرکت، بدون اسـپور، کاتـالاز منفـی، احیـا نیتـرات منفـی، سـیتوکروم اکسیداز منفی هستند که قادر به ذوب ژلاتین و تولید انـدول نمـیباشـند. همـهی بـاکتریهـای اسـید لاکتیـک متابولیسـمی تخمیری داشته و به شدت ساکارولیتیک هستند که محصول نهایی عمدهی حاصل از مصرف کربوهیدرات، اسید لاکتیک مـی-
باشد .[3] اگر چه گروه باکتریهای اسید لاکتیک به طور دقیق تعریف نشده و مرزهای آن دقیق مشخص نیست، تمام اعضـای آن دارای ویژگی مشترک تولید اسیدلاکتیک از هگزوزها میباشند. تولید غذاهای تخمیری، افزودنیها، نوشیدنیهای تخمیری، اگزوپلیساکاریدها، باکتریوسین و افزایش کیفیت نگهداری و ماندگاری فراوردههـای غـذایی از کاربردهـای مهـم بـاکتریهـای
اسیدلاکتیک هستند که همه آنها اهمیت این باکتریهای را به عنوان گروهی بسیار مهم در میکروبیولوژی صـنعتی، غـذایی و پزشکی مطرح میکنند.[6] طی سالهای گذشته، روشهای مولکولی به عنوان روشهای موثر جهت شناسـایی فلـور غالـب در جمعیتهای میکروبی پیچیده از جمله غـذاهـای تخمیـری مـورد اسـتفاده قـرار گرفتـه اسـت .[2] بـه کـارگیـری روشهـای بیوشیمیایی و فیزیولوژیکی بسیار وقتگیر و ابهام آمیز میباشد. بـرای مثـال L.gasseri و L.acidophilus هـر دو دارای زیستگاه یکسان و مشابهی هستند و از نظر خصوصیات فنوتیپی از یکدیگر قابل تشخیص نیستند. امـروزه شناسـایی عـلاوه بـر روشهای فنوتیپی با روشهای ژنوتیپی انجام میگیرد، چون تکمیل کننده هم هسـتند. بنظـر مـیرسـد دقیـقتـرین ابـزار بـرای شناسایی ایزولههای باکتریایی، توالییابی آنها باشد. با کمک بانکهای اطلاعاتی ریبوزومی وسیع و ابزارهای همردیفی تحـت وب، امکـان مقایسهی سریع توالیهایی که منجر به شاخصهای مشابهت شدهاند، را انجـام داد. تـوالییـابی ژن 16S rDNA احتمـالا بهتـرین ابـزار موجود برای شناسایی ایزولههای ناشناخته و یا تصدیق هویت کشتها (مانند سویههای پروبیوتیک یا کشتهای آغازگر) میباشد.[4]
مواد و روشها
نمونهبرداری
نمونههای ترخینه که به صورت محلی تولید شده بودند، از 9 محل استان کرمانشاه جمعآوری شد و نمونهها تحت شرایط دمای یخچال (4°C) ، برای جلوگیری از ایجاد آلودگی ثانویه، به آزمایشگاه منتقل گردیدند. کشت نمونهها و آزمایشهای میکروبی و بیوشیمیایی، در کوتاهترین زمان ممکن پس از انتقال به آزمایشگاه صورت پذیرفت.
جداسازی و طبقه بندی جدایههای باکتریهای اسید لاکتیک
بعد از رقت سازی و کشت، به منظور اطمینان از خالصسازی، هر ایزوله 3 بار کشت خطی داده شد. بعد از انجام رنگ-
آمیزی گرم و تست کاتالاز، ایزولههایی که گرم مثبت و کاتالاز منفی بودند، انتخاب شدند. خصوصـیات مورفولـوژیکی ایزولـهی مورد نظر زیر میکروسکوپ بررسی شد وکوکسی بودن یا باسیل بودن آنها تایید گشت. آزمایشهای بیوشیمیایی مورد استفاده در این پژوهش شامل این موارد بودند: رشد در دماهای 10 و 45 درجه سانتی گراد، رشد در 4/4 pH و 9/6، رشد در غلظـت 6/5 درصد نمک، توانایی تولید گاز بر طبق نتایج حاصل از آزمایشهای بیوشیمیایی کوکسیهای گـرم مثبـت، کاتـالاز منفـی، هوموفرمانتتیو، قادر به رشد در دمای 10°C و 45°C و قادر بـه رشـد در غلظـت 6/5% نمـک و pH=9/6 بـه عنـوان جـنس
انتروکوکوس در نظر گرفته شدند. کوکسیهای گرم مثبت، کاتالاز منفی، هوموفرمنتاتیو با آرایش تتراد به عنوان پدیوکوکوس و
کوکسیهای گرم مثبت، کاتالاز منفی و هتروفرمنتاتیو به عنوان لوکونوستوک در نظر گرفته شدند. جـنس لاکتوباسـیلوس بـه دلیل تنوع گسترده و دارا بودن گونههای متعدد، نسبت به تستهای بیوشیمیایی جوابهای متنوعی از خود بروز دادند. پـس از
شناسایی تا مرحلهی جنس، ایزولههـای تاییـد شـده بـه عنـوان جـنسهـای لاکتوباسـیلوس، پـدیوکوکوس، لوکونوسـتوک3 و
انتروکوکوس به منظور طبقهبندی و سپس انجام آزمونهای مولکولی تحت آزمون تخمیر کربوهیدرات قرار گرفتند. برای انجـام
تستهای تاییدی تخمیری، از ده نوع قند اسـتفاده گردیـد کـه شـامل: گلـوکز، سـاکارز، گـالاکتوز، فروکتـوز، لاکتـوز، مـالتوز،
سوربیتول، رافینوز، ملیبیوز و مانیتول بودند. محیط کشت مورد استفاده جهت انجام این آزمون فنل رد بـراث پایـه4 (کیولـب،
کانادا)5 بود.
شناسایی مولکولی ایزولهی باکتریهای اسید لاکتیک
استخراج DNA
از آنجا که برای تکثیر ناحیهی S r RNAٌّ نیاز به DNAای میباشد که دارای بیشترین غلظت و کمترین مقدار بازدارنده باشد، بنابراین برای استخراج سایر ایزولههایی که PCR در موردشان صورت پذیرفت، کیتهای مخصوص استخراج DNA باکتریهای گرم مثبت، با دیوارهی سخت (ًًٌَ؛(S، از شرکت دنازیست ایران خریداری شد.
انجام واکنش PCR
برای توالییابی و شناسایی دقیق ایزولهها به روش مولکولی، تکثیر ژن 16S rRNA که بـر اسـاس نـواحی محافظـت
شدهی این ژن عمل میکند، انجام شد. برای انجام واکنش PCR از پرایمرهای 1492R و 27FYM استفاده شـد. واکـنش در
یک مخلوط 25 l انجام شد که شامل اجزای زیر بود:
