بخشی از مقاله
بررسي اثر داروي RNAي آنتي سنس بر دو دودمان سلولي سرطان پروستات
خلاصه
از نظر آماري، سرطان پروستات پس از سرطان معده ، داراي بالاترين شيوع در مردان ايراني است . هر چند داروهاي شيميايي موجود در بازار، اثر مناسبي در کاهش سرعت پيشرفت اين بيماري دارند؛ اما منحني رشد اين سرطان پس از مدتي از مصرف دارو دوباره سير صعودي پيدا مي کند. با توجه به اين که مشخص شده بيان بالاي ژني موسوم به clu در اين شرايط سبب بقا و زنده ماندن سلولهاي سرطاني تحت درمان با دارو مي شود، کاهش ميزان محصول اين ژن با اوليگوي آنتي سنس RNA که از بيان mRNAي آن جلوگيري مي کند، مي تواند راه حل مناسبي براي ممانعت از شروع مجدد پيشرفت بيماري باشد.
در تحقيق حاضر، توالي ژن clu، بعد از استخراج از بانک اطلاعاتي، مورد بررسي قرار گرفته و اوليگوي آنتي سنس به طول ٢١ نوکلئوتيد براي منطقه اي از آن که شامل پروموتور بود، ساخته شد. اوليگوي آنتي سنس به صورت فسفروتيوايت ساخته شده و با غلظتهاي مختلف بر دو دودمان سلولي سرطان پروستات به نام هاي PC٣ و LNCaP اثر داده شد. در ادامه ، با انجام سنجش MTT، به مشاهده اثر تيمارهاي مختلف پرداخته شد. مشاهدات نشان داد که ، اوليگوي آنتي سنس سبب مرگ سلول هاي سرطاني شده و بيشترين اثر آن در غلظت ٢٠٠ نانو مولار حاصل مي شود. با توجه به نتايج به دست آمده ، مشخص مي شود که کاهش ميزان پروتئين کلاسترين که محصول ژن clu مي باشد، از بقاي سلولهاي سرطاني مذکور جلوگيري کرده و به اين ترتيب باعث کاهش بيماري مي شود. در مطالعات بعدي مي توان اثر اوليگوي آنتي سنس را به همراه اروي شيميايي بر روي اين سلولها مورد بررسي قرار داد.
کلمات کليدي : سرطان پروستات ، RNAي آنتي سنس ، کلاسترين مقدمه
سرطان يکي از معضلات اصلي سلامت عمومي در ايران ( و البته جهان ) است . براساس گزارشات اخير وزارت بهداشت ، درمان و آموزش پزشکي، پس از بيماريهاي قلبي – عروقي و تصادفات جادهاي، سرطان سومين علت مرگ و مير در ايران بوده و طي دهههاي اخير در حال افزايش ميباشد. در بين سرطان هاي رايج در ميان زنان ايراني، سرطان سينه داراي بيشترين
فراواني بوده و در بين مردان ، سرطان پروستات پس از سرطان معده در رتبه اول قرار ميگيرد (٣). با توجه به افزايش روز
افزون اين بيماري مزمن وکشنده ، به نظر ميرسد تلاش در جهت يافتن داروهاي موثر و ايمن کاملا ضروري ميباشد.
از آنجايي که افزايش بيان برخي از ژنها تحت شرايط خاص سبب ايجاد بيماري و يا حتي عدم واکنش يک بيماري به داروي شيميايي ميگردد؛ کاهش بيان ژنهاي هدف در اين موارد راهکار مناسبي جهت درمان و رفع آن بيماري خواهد بود. در اين زمينه يکي از روشهايي که امروزه در جهان مورد توجه شرکتهاي داروسازي قرار گرفته ، استفاده از اوليگونوکلئوتيدهاي آنتيسنس ميباشد. مکانيسم عملکرد اين نوع از داروها به اين ترتيب است که رشته RNA ي آنتيسنس که داراي توالي مکمل mRNAي مربوط به ژن هدف ميباشد، به آن متصل شده و از ترجمه آن توسط ريبوزوم ممانعت به عمل ميآورد. به اين ترتيب ، پروتئين ژن هدف ساخته نشده و علت بروز بيماري مرتفع ميگردد(١).
يکي از بيماريهايي که در اين حيطه قابل دستورزي است ، سرطان ميباشد. تحقيقات مختلفي بر روي درمان سرطان با اين روش انجام شده است . در اين تحقيق ، براي درمان سرطان پروستات ، اوليگونوکلئوتيد آنتيسنسي که با بخشي از mRNA ي مربوط به پروتئين کلاسترين مکمل بوده و از بيان آن جلوگيري ميکند به شکل فسفروتيوايت ساخته شد. کلاسترين گليکوپروتئيني ميباشد از مرگ برنامه ريزي شده سلول جلوگيري نموده و در چندين سرطان انساني مانند سرطان پروستات ، سينه ، سلولهاي پوششي خاردار، مثانه و ريه دچار افزايش بيان ميگردد(٢و ٤و ٥و ٦و ٧و ٨و ٩و ١٠). از آنجايي که مهار بيان ژن کلاسترين سبب راهاندازي روند خودکشي سلولي در سلولهاي تحت شيميدرماني ميشود؛ اين ژن به عنوان هدف مناسبي جهت مطالعات کلينيکي درمان سرطان پروستات با RNA ي آنتيسنس انتخاب شده است .
در پروژه حاضر، اليگونوکلئوتيد آنتيسنس ساخته شده داراي ٢١ نوکلئوتيد بوده و براي منطقه آغاز ترجمه mRNA ي کلاسترين با مقادير مختلف در سلولهاي سرطاني پروستات وارد شده و اثرات حاصل مورد بررسي قرار ميگيرد.
مواد و روشها
رده هاي سلولي سرطان پروستات انسان : رده هاي سلولي PC٣ و LNCaP از موسسه پاستور ايران تهيه شد. سلولها در محيط
(Gibco) RPMI١٦٤٠ حاوي (FBS)Gibco ١٠ درصد و آنتي بيوتيک پني سيلين - استرپتومايسين کشت داده شد.
اوليگونوکلئوتيد آنتي کلاسترين : اين اوليگوي آنتي سنس با توالي '٣-CAGCAGCAGAGTCTTCATCAT-'٥ به صورت فسفروتيوايت وتوسط شرکت تکاپوزيست ساخته شد.
تيمار سلول ها با اوليگوي آنتي سنس : براي افزايش جذب اوليگونوکلئوتيدها توسط سلول هاي مورد نظر، از ليپوفکتامين (Roche) استفاده شد. براي اين منظور، پس از تريپسينه کردن لايه هاي سلولي PC٣ و LNCaP کشت داده شده در فلاسک هاي ٢٥ سانتي متر مربع ، تعداد ٥٠٠٠ سلول به هر چاهک پليت ٩٦ خانه اي که حاوي ١٠٠ميکرو ليتر محيط کشت بود منتقل شد. جهت اتصال سلول ها به بستر، پليت به مدت يک شب در گرمخانه با دماي ٣٧ درجه سانتي گراد قرار داده شد. ليپوفکتامين و اوليگوي آنتي سنس در محيط کشت بدون سرم و آنتي بيوتيک به مدت ٢٠ دقيقه در گرمخانه گذاشته شد. غلظت اوليگوي آنتي سنس و ليپوفکتامين به ترتيب ٥ پيکومول و ٠.٢٥ميکرو ليتر در ١٠ ميکروليتر محيط کشت بود. محيط کهنه از چاهک ها خارج شده و محيط جديد حاوي غلظت هاي ٥٠، ١٠٠، ٢٠٠ و ٥٠٠ نانومولار از اوليگوي آنتي سنس به چاهکهاي داراي سلول اضافه شد. براي هر غلظت ٣ تکرار منظور شد. سپس ، گرم خانه گذاري به مدت ٤ ساعت انجام شد. محيط جديد حاوي آنتي بيوتيک و سرم جايگزين محيط داراي اوليگو شد. پس از ٢٠ ساعت ، مجددا عمل ليپوفکشن مشابه قبل انجام شد.در انتها سلولها به مدت ٣ روز با محيط حاوي سرم و آنتي بيوتيک در گرمخانه گذاشته شد.
سنجش MTT: براي ارزيابي اثر دارو بر روي سلولها از کيت سنجش MTT (ايده زيست ) استفاده شد. محيط کشت چاهک ها با محيط کشت تازه بدون فنل رد جايگزين شد. سپس به هر چاهک ١٠ ميکروليتر محلول ١٢ ميلي مولار MTT اضافه شده و به مدت ٤ ساعت در گرمخانه گذاشته شد. سپس از محلول رويي به آرامي برداشته شد به طوري که در هر چاهک ٢٥ ميکروليتر باقي بماند.٥٠ ميکروليتر محلول DMSO به هر چاهک اضافه شد. پس از ١٠ دقيقه ، با دستگاه الايزا ريدر(TECAN) در طول موج ٥٦٠ ناومتر خوانش انجام شد.
محاسبه آماري : با استفاده از نرم افزار SPSS روش (ANOVA) با سطح معني داري ٠.٠٥انجام شد.
نتايج
اثر سيتوتوکسيسيتي اوليگونوکلئوتيد آنتي سنس بر روي سلولهاي PC٣ و LNCaP در شکل ١ و ٢ نشان داده شده است . در سلولهاي PC٣ بين گروه شاهد با سلول هاي تيمار شده اختلاف معني داري مشاهده شد. همانطور که در شکل ١ مشخص است از غلظت ١٠٠ نانومولار اوليگو به بعد اثر به وجود آمده يکسان مي باشد. در سلول هاي LNCaP نيز، اثر مشابهي ديده شد. اما نتيجه در مورد تمام غلظتها يکسان است . به نظر مي رسد در مورد اين رده سلولي بايد غلظتهاي کمتر از ٥٠ نانومولار هم مورد آزمايش قرار گيرد.
