بخشی از مقاله
چکیده
گونههاي فعال اکسیژن تولیدي توسط گیاهان با داشتن خواص دوگانه در غلظتهاي بالا و پایین اعمال زیادي انجام میدهند. در این تحقیق از نانوامولسیونهاي صمغ زدو/ اسانس آویشنشیرازي جهت کنترل گونههاي فعال از یکسو و بررسی بیان آنزیم NAD - P - H oxidase از سوي دیگر استفاده شد. نانوامولسیون محتواي فنول - بررسی روش فولین-سیوکالتو - ، توانایی مهار رادیکالهاي ABTS، پراکسید هیدروژن بالایی - در خارج از سلول - از خود نشان داد. از طرفی در غلظتهاي 25، 50 میکروگرم در میلیلیتر موجب افزایش و در غلظتهاي 100، 150 و 200 موجب کاهش بیان میشود. به نظر میرسد نانوامولسیون توانایی کنترل تنشهاي اکسیدي دارد.
مقدمه
تولید گونههاي فعال اکسیژن - ROS - امري اجتناب ناپذیر از متابولیسم هوازي است. از مهمترین گونههاي فعال اکسیژن میتوان به آنیون سوپراکسید، رادیکال هیدروکسیل، پراکسید هیدرژن و اکسیژن تنها اشاره کرد. این ترکیبات توسط فعالیت میتوکندري، کلروپلاست، پراکسیزوم، و آنزیمهاي خانواده NAD - P - H oxidase تولید میشوند. در زمان تابشهاي شدید خورشید، اشعه فرابنفش و علفکشها سیستم اصلی در تولید گونههاي فعال نشت الکترون از زنجیرههاي انتقال الکترون کلروپلاست، میتوکندري و پراکسیزوم بوده، اما در زمان تنشهاي زخم، حمله پاتوژن، خشکی و شوري مهمترین عامل در ایجاد آنها آنزیمهاي خانواده NAD - P - H oxidase هستند.
آنزیمهاي خانواده NOX، واقع در غشاي سلولی، به دلیل این که بزرگترین تولید کنندگان گونههاي فعال اکسیژن هستند، نقش اساسی را در پاسخهاي ایمنی گیاه بازي می-کنند. آنها آنیون سوپراکسید را با انتقال الکترون از NAD - P - H به اکسیژن مولکولی تولید میکنند
گونههاي فعال در سطح فیزیولوژیکی به عنوان مولکولهاي پیامرسان در بسیاري از فعالیتهاي سلولی عمل کرده اما در غلظتهاي بالا، صدمات جبران ناپذیري را به پروتئینها، لیپیدها، کربوهیدراتها و اسیدهاي نوکلئیک میکنند و تنش اکسیدي را که در نهایت به مرگ سلول منجر میشود به وجود آورند .[2] گیاهان حاوي مجموعهاي از سیستمهاي دفاع آنتیاکسیدانی آنزیمی - سوپراکسید دیسموتاز، کاتالاز و پراکسیدازها - و غیرآنزیمی - اسیدآسکوربیک، فنول، فلاونوئید و... - هستند .
بنابراین جهت کنترل گونههاي فعال در حد فیزیولوژیک و مقابله با تنشهاي تنشهاي اکسیدي، تقویت قدرت آنتی اکسیدانی سلول از یک سو و کنترل آنزیمهاي تولید کننده گونههاي فعال اکسیژن از سوي دیگر امري ضروري به نظر میرسد. در این میان گیاهان دارویی مانند آویشن شیرازي - Zataria multiflora - از خانواده نعناعیان با داشتن ترکیبات فنولی مانند تیمول و کارواکرول داراي خواص ضد میکروبی، ضد قارچی و آنتی اکسیدانی ویژهاي است
با وجود مزایاي مختلف، استفاده از اسانس گیاهان دارویی داراي محدودیتهایی از جمله ناپایداري، تبخیر و فراریت است. در این راستا، از جمله روشهاي برطرف کردن این مشکلات و حفظ خواص آنتی اکسیدانی، کپسوله کردن اسانسها توسط پلیمرهاي زیستی مانند صمغ زدو در اندازه نانو است. زدو، صمغی - گروهی از پلی ساکاریدها - است شفاف، به سه رنگ سفید، زرد و قرمز که از درخت بادامکوهی - Amygdalus Scoparia - تراوش میشود. این صمغ که به نامهاي صمغ فارسی و شیرازي نیز معروف است جهت کپسوله سازي، امولسیون کنندگی، پایدارکنندگی و بهبود بافت در صنایع غذایی کاربرد دارد
در این تحقیق نانوامولسیونهاي صمغ زدو/ اسانس آویشن شیرازي را از لحاظ محتواي فنول و خواص مهار رادیکالهاي ABTS و پراکسید هیدروژن در خارج از سلول از یک سو و تاثیر این نانوامولسیونها را در غلظتهاي مختلف بر بیان آنزیم هاي خانواده NAD - P - H oxidase - بزرگترین تولیدکنندگان گونههاي فعال اکسیژن - از سوي دیگر مورد بررسی قرار دادیم.
مواد و روشها
آماده سازي صمغ زدو، اسانس آویشن شیرازي و دیسپرژنهاي صمغ زدو، صمغ زدو/اسانس آویشن صمغ زدو از اطراف شهرستان مرودشت و ارسنجان جمع آوري، نمونهها پودر شده و از الک 0/1 سانتیمتر عبور داده و پودر ریز و یکنواختی به دست آمد.
جهت آماده سازي نانوامولسیون صمغ زدو، یک گرم از پودر را در 80 میلی لیتر آب مقطر در دماي 50 درجه حل کرده بعد از سونیکه شدن با امواج مافوق صوت 140 - وات - در دماي 30 درجه به مدت 5 دقیقه، به نانوامولسیون تولیدي 100 میلی گرم پلی زوربات 20 - سورفاکتانت - اضافه در پایان در دماي 40 درجه حجم محلول را با آب مقطربه 100 میلیلیتر رساندیم. بخشهاي هوایی آویشن شیرازي را از اطراف شهرستان ارسنجان در استان فارس تهیه، اسانس گیري از برگها به روش تقطیر آبی با دستگاه کلونجر به مدت 3 ساعت صورت گرفت.
اسانسها با سولفات سدیم بدون آب خشک و در دماي 5 درجه سانتیگراد در شیشه هاي تیره رنگ که با فویل آلومینیومی پوشیده شده بود، نگه داري شدند. جهت آماده سازي نانوامولسیون صمغ زدو/ اسانس آویشن یک گرم از پودر صمغ زدو را در 80 میلی لیتر آب مقطر در دماي 50 درجه حل کرده بعد از سونیکه شدن با امواج مافوق صوت 140 - وات - در دماي 30 درجه به مدت 5 دقیقه، به نانوامولسیون صنغ زدو یک میلیلیتر اسانس آویشن، 100 میلیگرم پلی زوربات 20 - سورفاکتانت - اضافه در پایان در دماي 40 درجه حجم محلول را با آب مقطربه 100 میلیلیتر رساندیم. نانوامولسیون نهایی در دماي 4 درجه نگه داري شدند.
تعیین محتواي فنول کل
میزان محتواي فنول در نانوامولسیون بر اساس روش رنگ سنجی فولین– سیوکالتو و گالیک اسید به عنوان استاندارد انجام شد. 200 میکرولیتر از نانوامولسیون یا استاندارد گالیک اسید 0 -500 - میکروگرم در میلیلیتر گالیک اسید در آب مقطر - به یک میلیلیتر معرف فولین سیوکالتو 10 - درصد - افزوده، به مدت پنج دقیقه در دماي اتاق شیک و سپس 300 میکرولیتر کربنات سدیم 10 - درصد - به آنها اضافه و جذب در طول موج 765 نانومتر با اسپکتوفتومتر خوانده شد
تعیین توانایی مهار رادیکال ABTS توسط نانوامولسیون
20 میکرولیتر از نانوامولسیون یا استاندارد گالیک اسید به 1 میلیلیتر از محلول رادیکال آزاد 7 - ABTSمیلی مولار ABTS، 2/54 میلیمولار پرسولفات پتاسیم - به رنگ سبز -آبی افزوده و جذب نانوامولسیون در طول موج 734 نانومتر با اسپکتوفوتومتر خوانده شد. درصد مهار ABTS با استفاده از فرمول زیر محاسبه میشود
تعیین مهار رادیکال پراکسید هیدروژن توسط نانوامولسیون
جهت تعیین فعالیت مهار کنندگی رادیکال پراکسید هیدروژن توسط نانوامولسیون، 20 میکرولیتر نانوامولسیون را با یک میلی-لیتر از محلول پراکسید هیدروژن 50 - میلیمولار در 100 میلیمولار بافر فسفات با - pH=7/4 در 37 درجه به مدت 60 دقیقه انکوبه و جذب نانوامولسیون و محلول پراکسید هیدروژن بدون آنتیاکسیدان در طول موج 230 نانومتر با اسپکتوفوتومتر خوانده شد. درصد مهار به صورت زیر محاسبه شد:
بررسی بیان ژن NAD - P - H oxidase در گندم
بذرهاي گندم رقم سیروان از مرکز تحقیقات کشاورزي استان فارس تهیه، پس از ضد عفونی در اتاقک کشت به مدت 14 روز تحت شرایط 8/16 روشنایی/ تاریکی، دماي روز/شب 24/27 درجه و رطوبت نسبی 60 درصد کشت شدند. وقتی اندازه برگها به 10 سانتیمتر رسید سه روز نهالهاي گندم را با 50 میلیلیتر از غلظتهاي - 25، 50 ، 100، 150 و 200 میکروگرم در میلیلیتر - دیسپرژن صمغ زدو/ اسانس آویشن شیرازي رقیق شده با آب شیر، تیمار و غلظت یکسانی از نانوامولسیون صمغ زدو نیز به عنوان شاهد استفاده شد. 24 ساعت بعد، برگهاي گندم جهت استخراج RNA و بررسی بیان ژن NOX برداشت و در نیتروژن مایع در دماي -80 درجه سانتی گراد نگهداري شدند.
با استفاده از کیت شرکت دنا زیست و دستورالعمل شرکت سازنده RNA از بافت برگی استخراج شد. کمیت RNA با استفاده از نانودراپ - DE, USA Themo Fisher Scientcec, Wilmington - ND1000 در طول موج 260 نانومتر و کیفیت آن روي ژل الکتروفورز - آگارز یک درصد - بررسی شد. جهت حذف DNA ژنومی از آنزیم DNase1 - Thermo Fisher - استفاده و سنتز cDNA - Thermo Fisher - بر اساس دستورالعمل انجام گرفت.
بررسی بیان ژن NOX با استفاده از دستگاه ترموسایکلر Line- gene K و کیت SYBR Premix Ex Taq TM II، - Taraka, Japan - انجام شد. ترکیب واکنش Real time PCR شامل5 میکرولیتر 5 cDNA بار رقیق شده، 10 میکرولیتر 1× QuantiFast SYBER Green PCR Master mix - حاوي SYBER Green، Taq DNA پلیمراز و بافر - PCR، آغازگرهاي رفت، برگشت هرکدام 0/6 میکرولیتر و آب عاري از نوکلئاز 3/8 میکرولیتر در حجم نهایی 20 میکرولیتر فراهم گردید. واکنش PCR مطایق دستورالعمل کیت انجام شد.
